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松尾 龍人; 荒田 敏昭*; 小田 俊郎*; 中島 健次; 河村 聖子; 菊地 龍弥; 藤原 悟
Biochemistry and Biophysics Reports (Internet), 6, p.220 - 225, 2016/07
Hydration water is essential for a protein to perform its biological function properly. In this study, the dynamics of hydration water around F-actin and myosin subfragment-1 (S1), which are the partner proteins playing a major role in various cellular functions related to cell motility, was characterized by incoherent quasielastic neutron scattering (QENS). The QENS spectra of hydration water around F-actin and S1 provided the translational diffusion coefficient, the residence time, and the rotational correlation time. The differences in these parameters indicate a significant difference in mobility of the hydration water between S1 and F-actin: S1 has the typical hydration water, the mobility of which is reduced compared with that of bulk water, while F-actin has the unique hydration water, the mobility of which is close to that of bulk water rather than the typical hydration water around proteins.
松尾 龍人; 武田 壮一*; 小田 俊郎*; 藤原 悟
Biophysics and Physicobiology (Internet), 12, p.145 - 158, 2015/12
Troponin (Tn), consisting of three subunits, TnC, TnI, and TnT, is a protein that plays a major role in regulation of muscle contraction. Various mutations of Tn cause familial hypertrophic cardiomyopathy. Here we focus on the mutations E244D and K247R of TnT, which induce an increase in the maximum tension of cardiac muscle without changes in Ca
-sensitivity, and carried out small-angle X-ray scattering experiments on the Tn core domain containing the wild type subunits and those containing the mutant TnT in the absence and presence of Ca. Changes in the overall shape induced by the mutations were detected for the first time by the changes in the radius of gyration and the maximum dimension between the wild type and the mutants. Analysis by model calculations shows that TnC adopts a dumbbell structure regardless of the mutations, and that the mutations change the distributions of the conformational ensembles so that the flexible N- and C-terminal regions of TnT become close to the center of the whole molecule.
松尾 龍人; 荒田 敏昭*; 小田 俊郎*; 中島 健次; 河村 聖子; 菊地 龍弥; 藤原 悟
Biochemical and Biophysical Research Communications, 459(3), p.493 - 497, 2015/04
被引用回数：4 パーセンタイル：12.82(Biochemistry & Molecular Biology)Various biological functions related to cell motility are driven by the interaction between the partner proteins, actin and myosin. To obtain insights into how this interaction occurs, the internal dynamics of F-actin and myosin subfragment-1 (S1) were characterized by quasielastic neutron scattering measurements on the solution samples of F-actin and S1. Contributions of the internal motions of the proteins to the scattering spectra were separated from those of the global macromolecular diffusion. Analysis of the spectra arising from the internal dynamics showed that the correlation times of the atomic motions were about two times shorter for F-actin than for S1, suggesting that F-actin fluctuates more rapidly than S1. It was also shown that the fraction of the immobile atoms is larger for S1 than for F-actin. These results suggest that F-actin actively facilitates the binding of myosin by utilizing the more frequent conformational fluctuations than those of S1.
松尾 龍人; 荒田 敏昭*; 小田 俊郎*; 藤原 悟
Biophysics, 9, p.99 - 106, 2013/07
Hydration structures around F-actin and myosin subfragment-1 (S1), which play central roles as counterparts in muscle contraction, were investigated by small-angle X-ray scattering (SAXS) and small-angle neutron scattering (SANS). The radius of gyration of S1 was evaluated to be 41.3 
1.1 
for SAXS, 40.1 3.0 for SANS in H
O, and 37.8 0.8 for SANS in DO, respectively. The values of the cross-sectional radius of gyration of F-actin were 25.4 0.03 for SAXS, 23.4 2.4 for SANS in HO, and 22.6 0.6 for SANS in DO, respectively. Analysis showed that the hydration shell of S1 has the average density 10-15% higher than bulk water, being the typical hydration shell, while the hydration shell of F-actin has the average density more than 19% higher than bulk water, indicating that F-actin has a denser, unusual hydration structure. The results indicate a difference in the hydration structures around F-actin and S1.
藤原 悟; Plazanet, M.*; 小田 俊郎*
Biochemical and Biophysical Research Communications, 431(3), p.542 - 546, 2013/02
被引用回数：4 パーセンタイル：11.12(Biochemistry & Molecular Biology)Quasi-elastic neutron scattering experiments of powder samples of F-actin and G-actin, hydrated either with DO or HO, at hydration ratios of 0.4 and 1.0, were performed. Combined analysis of the quasi-elastic neutron scattering spectra provided the parameters characterizing the water dynamics in the first hydration layer and those outside of the first layer. The translational diffusion coefficients (D
) of the hydration water in the first layer were found to be 1.2 
10
cm
/s and 1.7 10 cm/s for F-actin and G-actin, respectively, while that for bulk water was 2.8 10 cm/s. The residence times were 6.6 ps and 5.0 ps for F-actin and G-actin, respectively, while that for bulk water was 0.63 ps. These differences between F-actin and G-actin, indicating that the hydration water around G-actin is more mobile than that around F-actin, are in concert with the results of the internal dynamics of F-actin and G-actin, showing that G-actin fluctuates more rapidly than F-actin. This implies that the dynamics of the hydration water is coupled to the internal dynamics of the actin molecules. The D values of the water molecules outside of the first hydration layer were found to be similar to that of bulk water though the residence times are strongly affected by the first hydration layer. This supports the recent observation on intracellular water that shows bulk-like behavior.
藤原 悟; Plazanet, M.*; 松本 富美子; 小田 俊郎*
European Biophysics Journal, 40(5), p.661 - 671, 2011/05
被引用回数：10 パーセンタイル：29.93(Biophysics)The quasielastic neutron scattering (QENS) experiments were carried out to characterize the internal dynamics of the protein, actin in the polymerized form (F-actin) and the monomeric form (G-actin). To investigate the effects of hydration, the measurements were done on the powder samples containing only the first layer of hydration water, and those containing more layers of water. The QENS spectra obtained indicated that the internal motions of both F-actin and G-actin have distributions of motions with distinct correlation times and amplitudes. Increasing hydration changes relative populations of these distinct motions. The effects of hydration were shown to be different between F-actin and G-actin. The elastic incoherent neutron scattering measurements provided the concerted results. The observed effects were interpreted in terms of the differences in the dynamical heterogeneity of G-actin and F-actin.
松本 富美子; 弟子丸 俊吾*; 小田 俊郎*; 藤原 悟
Analytical Biochemistry, 399(2), p.299 - 301, 2010/04
被引用回数：2 パーセンタイル：58.78(Biochemical Research Methods)天然の筋肉の細いフィラメント及び大腸菌に発現させた組換えトロポニン構成成分から筋肉の細いフィラメントを再構成する技術を開発した。この技術により、pH6.2において20%グルセロール及び0.3M KCl存在下で、再構成されたトロポニン複合体が天然の細いフィラメント中に交換導入される。90%以上の内在トロポニン複合体が組換えトロポニン複合体に交換される。この技術により調製された再構成細いフィラメントの構造及びCa感受性が保持されることが、X線繊維回折測定、並びに、細いフィラメントにより活性化されるミオシンサブフラグメント1のATP分解活性の測定により確認された。
藤原 悟; Plazanet, M.*; 松本 富美子; 小田 俊郎*
Biophysical Journal, 94(12), p.4880 - 4889, 2008/06
被引用回数：9 パーセンタイル：21.47(Biophysics)アクチンは、ほぼすべての真核細胞内に存在し、細胞運動や輸送等にかかわる実に多様な機能を持つ。アクチン単量体(G-アクチン)は重合して繊維状重合体(F-アクチン)を形成するが、多様なアクチンの機能は、種々の蛋白質との相互作用を可能とするF-アクチンの柔らかさのゆえである。F-アクチンの柔らかさの起源を明らかにするための第一段階として、われわれはピコ領域におけるアクチンの運動特性の測定を、中性子非干渉性弾性散乱(EINS)法を用いて行った。G-アクチン及びF-アクチンの水和粉末試料についてEINS測定を行い、アクチン分子内の原子の平均自乗変位の温度依存性を調べた。その結果、平均自乗変位には150K付近及び245K付近に2つの転移が観測されること、その振舞がG-アクチンとF-アクチンで異なること、そしてG-アクチンの方がF-アクチンより"柔らかい"ことが示された。さらに、アクチンは、G-アクチンとF-アクチンで同様の柔らかさを持つ領域と、G-アクチンにおいてより柔らかくなる領域という動的不均一性を持っていることが示唆された。
松本 富美子; 前田 佳代*; 似内 靖*; 小田 俊郎*; 前田 雄一郎*; 藤原 悟
no journal, ,
遺伝性心筋症(HMC)は心臓の収縮機能やカルシウム調節に異常をきたす疾患で、筋収縮調節を担う蛋白質であるトロポニン(Tn;TnT, TnI, TnCからなる複合体)の変異により生じることが報告されている。われわれはTnの変異により生じるHMCの発症原因を探るため、Tn結晶構造中でIT-armと呼ばれるコイルドコイル中に存在する2つの変異(TnT(E244D), TnT(K247R))に注目して研究を行った。これまで、TnT(E244D)変異は心筋のカルシウム感受性を変えることなく最大張力を増大させるという報告があるが、TnT(K247R)についての報告はまだない。われわれは、これらの部位に種々の変異を導入し(E244; D, M, A, K and K247; R, E, A)、それにより生じる筋原繊維の機能異常を系統的に調べた。その結果、われわれは、IT-arm中に存在する2つの心筋症型変異が、同様の機能異常を引き起こすことを明らかにした。さらにこれらの部位が、IT-armの柔軟性を決定付けさせるような非常に特徴的なアミノ酸ネットワークを形成していることを見いだした。発表では変異により生じると考えられるIT-armの柔軟性変化と機能異常との関連について述べ、HMCの原因について考察する。
藤原 悟; 小田 俊郎*; Plazanet, M.*; 松本 富美子
no journal, ,
アクチンは、ほぼすべての真核細胞内に存在し、細胞運動や輸送等にかかわる実に多様な機能を持つ。アクチン単量体(G-アクチン)は重合して繊維状重合体(F-アクチン)を形成するが、多様なアクチンの機能は、種々の蛋白質との相互作用を可能とするF-アクチンの柔らかさのゆえである。F-アクチンの柔らかさの起源を明らかにするための第一段階として、われわれはピコ領域におけるアクチンの運動特性の測定を、中性子非干渉性弾性散乱(EINS)及び準弾性散乱(QENS)法を用いて行った。EINS測定により見積もられたアクチン分子内の原子の平均自乗変位の温度に依存した振舞がG-アクチンとF-アクチンで異なることが示された。また、QENSスペクトルから、アクチン分子内の原子の運動は、制限された空間内における拡散的運動として記述できること、並びにスペクトルがG-アクチンとF-アクチンで異なることが明らかとなった。これらのスペクトルの解析の結果、アクチンは、G-アクチンとF-アクチンで同様の柔らかさを持つ領域と、G-アクチンにおいてより柔らかくなる領域という動的不均一性を持っていることが示唆された。
藤原 悟; Plazanet, M.*; 松本 富美子; 小田 俊郎*
no journal, ,
アクチンは、真核細胞に最も豊富に存在する蛋白質で、細胞運動や輸送等にかかわる実に多様な機能を持つ。アクチン単量体(G-アクチン)は重合して繊維状重合体(F-アクチン)を形成するが、多様なアクチンの機能は、種々の蛋白質との相互作用を可能とするF-アクチンの柔らかさに由来する。F-アクチンの柔らかさはアクチンの運動特性による。われわれはF-アクチンの柔らかさを理解するための第一段階として、アクチンの運動特性を、中性子非干渉性弾性散乱(EINS)及び準弾性散乱(QENS)法により測定した。EINS測定により見積もられたアクチン分子内の原子の平均自乗変位の温度に依存した振舞がG-アクチンとF-アクチンで異なることが示された。また、QENSスペクトルから、アクチン分子内の原子の運動は、制限された空間内における拡散運動と局所的なジャンプ運動の組合せとして記述できること、及びG-アクチンとF-アクチンの振舞が異なることが示された。これらの違いがアクチン分子内の動的不均一性によることが示唆された。
藤原 悟; 小田 俊郎*; Plazanet, M.*; 松本 富美子
no journal, ,
F-アクチンは、真核細胞に最も豊富に存在し、細胞運動に関係する実に多様な機能を持つ。どのようにして、このような多様な機能が可能となるかを理解するためには、アクチン分子の内部運動から分子間の相対的運動、そしてF-アクチン全体の運動までのさまざまなレベルでの運動特性を明らかにすることが重要である。われわれは、そのためにF-アクチン及びアクチン単量体(G-アクチン)の中性子非干渉性弾性散乱実験を行い、F-アクチン及びG-アクチンの運動特性の違いを明らかにした。さらにアクチン分子内部の運動特性を詳しく特徴付けるため、中性子準弾性散乱実験を行った。第1水和層まで含む水和粉末試料及び「バルク」水まで含む試料についての測定を行った結果、F-アクチン及びG-アクチンのいずれも、少なくとも2種類の異なった振幅と速度を持つ運動が存在すること、そして含水量の増大は、これらの動きを速くさせること、そしてG-アクチンはF-アクチンよりも、より大きな振幅及び速い速度の運動を示す傾向があることを明らかにした。
藤原 悟; Plazanet, M.*; 松本 富美子; 小田 俊郎*
no journal, ,
F-アクチンは、アクチン単量体(G-アクチン)の繊維状重合体であり、細胞運動に関係する実に多様な機能を持つ。どのようにして、このような多様な機能が可能となるかを理解するためには、アクチン分子の内部運動から分子間の相対的運動、そしてF-アクチン全体の運動までのさまざまなレベルでの運動特性を明らかにすることが重要である。われわれは、そのためにF-アクチン及びG-アクチンの中性子非干渉性弾性散乱実験を行い、F-アクチン及びG-アクチンの運動特性の違いを明らかにした。さらにアクチン分子内部の運動特性を詳しく特徴付けるため、中性子準弾性散乱実験を行った。第1水和層まで含む水和粉末試料及び「バルク」水まで含む試料についての測定を行った結果、F-アクチン及びG-アクチンのいずれも、少なくとも2種類の異なった振幅と速度を持つ運動が存在すること、そして含水量の増大は、これらの動きを速くさせること、そしてG-アクチンはF-アクチンよりも、より大きな振幅及び速い速度の運動を示す傾向があることを明らかにした。
藤原 悟; 松本 富美子; 中川 洋; 遠藤 仁*; 小田 俊郎*
no journal, ,
F-アクチンの細胞運動や輸送等にかかわる実に多様な機能を可能とするF-アクチンの柔らかさの起源を解明し、機能多様性の分子機構を明らかにするための第一段階として、さまざまな時空間階層における運動モードのうち、ピコ
ナノ秒領域におけるアクチンのダイナミクスの測定を行った。東京大学物性研究所所有の中性子スピンエコー分光器(iNSE)を用いて、時間領域30ナノ秒までのQ-領域0.030.2
の中性子スピンエコー測定を、F-アクチン溶液及びその対照としての単量体G-アクチン溶液のそれぞれについて行った。この時空間領域は、蛋白質の並進拡散や蛋白質内ドメインの運動などの起こる領域に対応し、中性子スピンエコー法によってのみ測定可能な時空領域である。得られた中間関数から、F-アクチン及びG-アクチンのいずれも単一の緩和過程で記述できることが示された。そして、緩和の早さ、すなわち(みかけの)拡散係数がF-アクチンの方が小さくなることが明らかとなった。G-アクチン及びF-アクチンのいずれも、単純な溶液中の自由併進拡散のみでなく、内部運動が影響していることが示唆された。
藤原 悟; Plazanet, M.*; 松本 富美子; 小田 俊郎*
no journal, ,
F-アクチンは、真核細胞に最も豊富に存在し、細胞運動に関係する実に多様な機能を持つ。このようなF-アクチンの多様な機能には、アクチン分子のらせん状重合体であるF-アクチンの「柔らかさ」に由来する。F-アクチン機能の多様性を理解するためには、F-アクチンの運動特性を明らかにしなければならない。われわれは、中性子非弾性散乱のさまざまな技術を用いてF-アクチン及びアクチン単量体(G-アクチン)の運動特性を調べてきた。中性子非干渉性弾性散乱測定を行い、得られた平均自乗変位の解析からF-アクチン及びG-アクチンの運動特性の違いを明らかにした。さらに中性子準弾性散乱測定によりアクチン分子内部の運動特性の特徴付けを行った結果、F-アクチン及びG-アクチンのいずれも、異なった振幅と速度を持つ運動が存在し、G-アクチンはF-アクチンよりも、より大きな振幅及び速い速度の運動を示す傾向があることを明らかにした。F-アクチンとG-アクチンの運動特性の違いは、この動的不均一性の違いに由来する。また、こうしたアクチン分子の内部運動に対する水和水の効果がF-アクチンとG-アクチンで異なっていることも併せて明らかにした。
藤原 悟; Plazanet, M.*; 松本 富美子; 小田 俊郎*
no journal, ,
アクチンは細胞運動に関係する実に多様な機能を持つ。アクチンは単量体(G-アクチン)が会合して繊維状会合体(F-アクチン)を形成し機能を発現するが、このような多様な機能の起源を理解するためには、アクチン分子の内部運動から分子間の相対的運動、そしてF-アクチン全体の運動までのさまざまなレベルでの運動特性を明らかにすることが重要である。われわれは、そのためにF-アクチン及びG-アクチンの中性子非干渉性弾性散乱実験を行い、F-アクチン及びG-アクチンの運動特性の違いを明らかにした。さらにアクチン分子内部の運動特性を詳しく特徴付けるため、中性子準弾性散乱実験を行った。第一水和層まで含む水和粉末試料及び「バルク」水まで含む試料についての測定を行った結果、F-アクチン及びG-アクチンのいずれも、複数の異なった振幅と速度を持つ運動が存在すること、そして含水量の増大は、これらの動きを速くさせること、そしてG-アクチンはF-アクチンより大きな振幅及び速い速度の運動を示す傾向があることを明らかにした。
藤原 悟; 米澤 康滋*; 松本 富美子; 小田 俊郎*; 武田 壮一*
no journal, ,
遺伝性心筋症は、心筋蛋白質の種々の変異により発症する。それらの変異蛋白質の中で、心筋収縮調節機構で重要な役割を果たすトロポニンの変異体に注目する。トロポニン(Tn)は3つのサブユニット(TnC, TnI, TnT)からなる蛋白質複合体である。トロポニンの種々の変異のうち、TnTのE244D変異及びK247R変異に注目する。これらの変異は、直接調節機能を担っている領域ではなく、Tn内の種々の調節領域をつなぐ領域に存在している。したがって、これらの変異がTn機能に及ぼす影響を調べることにより、心筋症発症機構のみならず、Tnの収縮調節機構そのものの解明につながりうると考えられる。これらのTn変異体研究の一環として、X線小角散乱法により、これらの変異体が溶液中でどのような構造をとっているかを調べた。その結果、変異体は、変異を持っていない通常のTnと同様にCa結合により構造変化が起こること、またTn変異体はTn野生体とは異なった構造をとることが明らかとなった。すなわち変異の導入によりTnの全体構造が変化することが示唆された。これはTnの変異により心筋症発症機構を考えるうえでの基礎をなす重要な結果である。
藤原 悟; Plazanet, M.*; 松本 富美子; 小田 俊郎*
no journal, ,
蛋白質アクチンは、真核細胞に最も豊富に存在し、細胞運動に関係する多様な機能を持つ。アクチン単量体(G-アクチン)は重合して螺旋状重合体F-アクチンを形成する。このF-アクチンの「柔らかさ」が機能の多様性において重要であることが指摘されているため、われわれは、F-アクチンの柔らかさの起源であるアクチンの内部運動特性を中性子散乱により調べてきた。中性子非干渉性弾性散乱及び中性子準弾性散乱(QENS)測定により、F-アクチン及びG-アクチンの運動特性の違いを示した。蛋白質の運動特性は、蛋白質水和水の運動特性と密接に関係すると言われている。そこで、F-アクチン及びG-アクチンの内部運動特性と水和水の運動特性との関係を調べるために、F-アクチン及びG-アクチンそれぞれのHO水和粉末試料及びDO水和粉末試料の中性子準弾性散乱測定を行い、その差から水和水のQENSスペクトルを抽出した。解析の結果、G-アクチン水和水の方がF-アクチン水和水よりも速い運動をすることが明らかとなった。これはF-アクチン及びG-アクチンの内部運動の違いと対応しており、水和水の運動が蛋白質内部運動に影響を及ぼすことを示唆している。
藤原 悟; Plazanet, M.*; 松本 富美子; 遠藤 仁; 小田 俊郎*
no journal, ,
アクチンは、真核細胞に最も豊富に存在し、細胞運動に関係する実に多様な機能を持つ蛋白質である。アクチン単量体(G-アクチン)は重合して繊維状重合体F-アクチンを形成する。このF-アクチンの"柔らかさ"が多様な機能の発現に重要であると言われている。われわれは、F-アクチン機能の多様性を理解するために、F-アクチンの柔らかさの起源であるアクチンの内部運動特性を中性子非弾性散乱のさまざまな手法を用いて調べてきた。ピコ秒時間領域の運動特性の直接測定可能な中性子非干渉性弾性散乱測定及び中性子準弾性散乱測定から、F-アクチン及びG-アクチンの運動特性が異なることが明らかとなった。さらに蛋白質の並進拡散や蛋白質内ドメインの運動などの起こる領域に対応するナノ秒領域の運動特性が測定できる中性子スピンエコー法による測定から、F-アクチンとG-アクチンの緩和過程が異なることが示された。また、その緩和過程に分子内の内部運動が影響していることが示唆された。
藤原 悟; 松尾 龍人; 松本 富美子; 小田 俊郎*; 武田 壮一*
no journal, ,
Various mutations in the regulatory proteins of muscle contraction, troponin (Tn), consisting of three subunits, TnC, TnI, and TnT, have been reported to cause familial hypertrophic cardiomyopathy. To elucidate the molecular mechanism of pathogenesis of these mutations, we focus on the mutations in the coiled-coil region of TnT, E244D and K247R, and performed small-angle X-ray scattering (SAXS) experiments on the solutions of Tn containing wild-type TnT, and those containing mutant TnT. It was shown that the structural changes of Tn are induced by these mutations. Analysis by molecular modeling suggested that these changes arise from the changes in the conformational fluctuations rather than distinct structural changes.
