Neutron diffraction study of cubic insulin at two different pDs

中性子結晶構造解析による正方晶インスリン内ヒスチジン側鎖のプロトン解離状態

石川 卓哉*; 田中 伊知朗*; 茶竹 俊行*; 栗原 和男; 大西 裕季*; 日下 勝弘; 玉田 太郎; 黒木 良太; 新村 信雄*

Ishikawa, Takuya*; Tanaka, Ichiro*; Chatake, Toshiyuki*; Kurihara, Kazuo; Onishi, Yuki*; Kusaka, Katsuhiro; Tamada, Taro; Kuroki, Ryota; Niimura, Nobuo*

アミノ酸側鎖のプロトン解離状態はタンパク質の生理反応や安定性に対し大きな影響を与える。しかし、その解離は側鎖周囲の環境にも依存し溶液のpHだけから推定は困難である。よって、プロトン解離状態の決定には実験的に測定することが必要となる。中性子回折法は、他の元素同様に水素と相互作用するため水素原子観察の有効な手段である。そこで、われわれはBIX-4回折装置(原子力機構JRR-3)を用い、pD=6(重水溶液を使用)でのインスリン正方晶結晶の中性子回折測定を行った。さらに既報のpD=9での中性子解析結果(Maeda, et al. 2004)及びpH=6でのX線解析結果(Diao, 2003)と比較考察した。試料調製では、結晶化曲線に基づき大型結晶を育成し、最後に水素原子由来バックグラウンドの低減のため重水溶液に置換した。回折実験では2.5分解能のデータ取得に成功した。この構造解析から、B鎖ヒスチジン(His)5番及び10番残基では側鎖のプロトン解離状態(遊離基の場合pK6)は異なり、pD=6, 9両方でHis5 Nのみ脱プロトン化し、それ以外はプロトン化していた。以上の結果は、中性子回折法がタンパク質のプロトン解離状態を決定する有力な方法であることを示している。

It is known that the protonation status of amino acid side chains can strongly affect the biological function and stability of a protein. It is often hard to estimate it because it depends also on the local environment of the side chain. Neutron diffraction is a powerful tool to observe hydrogen atoms because of its strong interaction with hydrogen. Thus, a neutron study of cubic insulin at pD 6 has been carried out using the BIX-4 diffractometer (JRR-3, JAEA) and the result was compared with the previous neutron study at pD 9 (Maeda, et al. 2004) and by X-ray at pH 6 (Diao, 2003). A large single crystal of cubic insulin was prepared based on the crystallization phase diagram. The crystal diffracted to 2.5 resolution. It was found that only N of His 5 in the B-chain is protonated whereas both N and N of His10 in the B-chain is protonated at pD 6 and the results at pD 9 are also the same (the pK of histidine side chains in the free form is around 6.0). These indicate that neutron diffraction study is useful to determine the protonation status of a protein.