中性子結晶構造解析を目的としたタンパク質工学によるヒト酸性FGF結晶の成長性の改変

Improvement of crystal growth of human acidic FGF by protein engineering for neutron crystallography

安達 基泰; 本庄 栄二郎; 玉田 太郎; Blaber, M.*; 黒木 良太

Adachi, Motoyasu; Honjo, Eijiro; Tamada, Taro; Blaber, M.*; Kuroki, Ryota

繊維芽細胞成長因子(FGF)は、細胞の増殖や分化を促進する因子であり、さまざまな生命活動に関与する多機能性分泌因子として注目されている。本研究では、ヒト酸性FGFの中性子構造解析によって全原子立体構造を明らかにし、ヒト酸性FGFの構造活性相関を解明することを目的とする。タンパク質を中性子構造解析するためには、体積の大きな結晶の作成が必要である。ヒト酸性FGFの結晶は1方向に薄い板状を示すので、分子接触面の改変により成長性の改変を試みた。X線結晶構造解析により既に得られているヒト酸性FGFの原子座標をもとに結晶内の分子パッキングを解析した結果、結晶のB軸方向に垂直な面において、分子間接触面積が小さく、しかも結晶学的対称軸付近で2つのGlu81の側鎖が隣接していた。そこでGlu81をAla, Val, Leu, Ser, Thr残基に置換したところ、Ser, Thrに置換した変異体において、より厚みを増した結晶が得られた。両変異体のX線結晶構造解析の結果、変異導入したSer及びThr側鎖のOH基が沈殿剤として使用している蟻酸を介して水素結合を形成していることが明らかとなった。

Human acidic fibroblast growth factor (haFGF) is a powerful mitogen and angiogenic factor. Our objective is to reveal structure function relationships of haFGF by protein neutron crystallography. For the determination of neutron crystal structures, large crystal in size is required. Since haFGF forms thin crystals, we tried improvement of crystal growth by changing amino acids at molecular interface. The analysis using X-ray crystal structure showed that the residue of Glu81 is located near Glu81 generated by crystallographic symmetry. Therefore, Glu81 was replaced with Ala, Val, Leu, Ser and Thr residue. The mutants of E81S and E81T provided larger crystal in size than that of WT. The X-ray structures of E81S and E81T showed that a molecule of formic acid bridges between the two Glu81 residues by hydrogen bonding.