Crystallization and preliminary neutron diffraction study of ADP-ribose pyrophosphatase from thermus thermophilus

超好熱菌由来のADPリボースピロフォスファターゼの結晶化と予備的中性子回折実験

安達 基泰; 玉田 太郎; 栗原 和男; 大賀 拓史*; 倉光 成紀*; 黒木 良太

Adachi, Motoyasu; Tamada, Taro; Kurihara, Kazuo; Oga, Takushi*; Kuramitsu, Seiki*; Kuroki, Ryota

ADPリボースピロフォスファターゼ(ADPRase)は、ADPリボースをリボース5'リン酸とAMPに加水分解する酵素である。本研究では、中性子結晶構造解析によって、ADPRaseの触媒反応に関与する水分子の役割や解離性アミノ酸のイオン化状態を明らかにし、触媒機構を詳細に解明することを目的としている。大腸菌を用いて組換え型ADPRaseを調製後、マクロシーディング法によって3.2 2.81.5(13mm)の結晶を取得した。得られた結晶を20日間重水素化溶液中でソーキングを行った後、JRR-3の回折計BIX-3を用いて回折データを測定した。予備的解析実験の結果、露光時間240分で2.1オングストロームの回折データが得られた。さらに、ADPRaseの完全重水素化の取り組みについても報告する。

ADP ribose pyrophosphatase (ADPRase) catalyzes the hydrolysis of ADP ribose to ribose 5' phosphate and AMP. In order to clarify the catalytic mechanism of ADPRase including ionization state of catalytic residues and role of water molecules on its catalytic function, recombinant ADPRase was expressed in and a large crystal was prepared by macro seeding. After the two months repeat of the macro seeding, a large crystal with the dimensions of 3.22.81.5 (13 mm) was grown in the sodium acetate buffer (pH 5.3) containing 20% glycerol, 0.2M ammonium sulfate, and 18% PEG4000 at 20C. Then, the crystal was soaked into the reservoir solution prepared using deuterated reagents for 20 days, and was mounted to a BIX-3 neutron diffractometer installed at the research reactor JRR-3 in JAEA. As a result of the preliminary experiments, neutron diffraction spots up to 2.1 resolution were observed in the still images taken by 240 minutes exposure.