A Novel methodology to characterize DNA damage utilizing phosphodiesterase I function

ホスホジエステラーゼIの機能を利用したDNA損傷を調べるための新しい方法

赤松 憲

Akamatsu, Ken

放射線によって生じるDNA損傷の種類・量・分布(損傷スペクトル)は線質あるいはそのエネルギーによって違うと考えられる。しかしながら、損傷の多様さ,直接・間接効果の寄与率,酸素濃度、さらには、実験条件等の多くの不確定要素のため、その違いに関する統一見解が得られていない。そこで、個々の損傷の化学構造に厳密にこだわらず、かつ損傷部位の脆弱性(pH・温度感受性が上がっている)に影響されにくい損傷スペクトル分析法を開発した。この方法では、分解酵素として、DNAの3'水酸基末端を認識し2'デオキシヌクレオシド-5'-リン酸を逐次切り出すホスホジエステラーゼI(SVPD)、及びアルカリホスファターゼを用いる。SVPDの基質特異性とそのミハエリス-メンテン型の反応速度論的性質を活用することによって、DNA鎖切断の3'末端におけるリン酸基の有無、ピペリジン脆弱性部位というカテゴリーで損傷を分類して定量することが可能である。本方法を用いることで、コバルト60線を照射したDNA薄膜試料では、鎖切断の収率がおよそ0.1mol/Jであることがわかった。この値は他の方法で見積もられた結果と矛盾しない。この方法体系を基礎にさまざまな酵素を組合せることで、これまでにわからなかった放射線DNA損傷スペクトルが明らかになると期待できる。

We have developed new-conceptual analytical methodology to estimate the DNA damage spectrum on natural DNA without radioisotope and fluorescent labeling. DNA damage is generally classified into two categories. one is "strand break", the other is "nucleobase lesion". There are two kinds of termini in the strand break pattern: the termini with or without phosphate. We have developed the protocols to quantify (1) 3'termini without phosphate, (2) 3'termini with phosphate, and (3) nucleobase lesions. An enzyme, phosphodiestrase I (snake venom phosphodiesterase (SVPD)), can recognize a 3'terminus without phosphate followed by production of DNA monomers (2'-deoxynucleoside-5'-phosphate) sequentially from the 3'terminus (3' 5'exonuclease function). Then, the yield of site (1) can be quantified since the amount of the DNA monomers produced during incubation for a given period is proportional to that of site (1). In addition, pre-treatment of irradiated DNA by another enzyme, calf intestine alkaline phosphatase (CIAP) enables site (2) to be recognized by SVPD, because CIAP removes phosphate at site (2) to convert into 3'OH terminus categorized in site (1). Furthermore, pre-treatment of irradiated DNA by a chemical, piperidine, can covert several electron-withdrawing nucleobase lesions into site (2), which can become recognizable by SVPD after CIAP pre-treatment as mentioned obove. As a result, in case of Co -irradiated dry DNA, the yields of total 3'termini, 3'termini without phosphate, 3'termini with phosphate, and piperidine-labile nucleobase lesions, are estimated to be 0.102, 0.024, 0.078, and 0.084, respectively. The de novo analytical protocol is unique in the idea itself, and future analyses based on the methodology will elucidate unknown DNA damage spectrum using a variety of combinations of enzymes.