8-oxoGを含むクラスターDNA損傷誘発突然変異における一本鎖切断の影響

Single strand break affects mutagenic potential of clustered DNA damage containing 8-oxoG

野口 実穂; 漆原 あゆみ*; 横谷 明徳; 鹿園 直哉

Noguchi, Miho; Urushibara, Ayumi*; Yokoya, Akinari; Shikazono, Naoya

疎に分布した一本鎖切断や塩基損傷などのDNA損傷は細胞内で効率よく修復され、細胞死や突然変異への寄与は小さいとされていた。しかし、放射線のLETが高くなると、DNA上に損傷が局所的に生じ、一本鎖切断や塩基損傷などがクラスター化した損傷が増加する。本研究では一本鎖切断と塩基損傷から成るクラスター損傷と突然変異誘発との関連を人工的に合成したモデルクラスター損傷を用いて検討した。今回われわれはクラスター損傷として8-oxoGのみの損傷、一本鎖切断と8-oxoGから成る損傷など数種類のクラスター損傷を作成した。損傷を含むオリゴヌクレオチドはプラスミドとつないだ後、野性株の大腸菌、及びグリコシラーゼ欠損株の大腸菌に形質転換した。その後プラスミドを大腸菌から回収し突然変異誘発頻度を求めた。今回用いたクラスター損傷の中で、2個の8-oxoGから成る損傷がすべての変異株で最も高い変異頻度を示した。しかし、2個の8-oxoGの近傍に1つの一本鎖切断を配置すると、すべての変異株で変異頻度は若干低下した。この損傷の変異率は1個の8-oxoGと一本鎖切断を相補鎖に配置した損傷とほぼ同程度の値であった。これらの結果から一本鎖切断が8-oxoGなどの塩基損傷と同一鎖の近傍に存在すると変異が抑制されることが示唆される。このような変異の抑制は一本鎖切断の修復又は複製が関与していることが予測され、クラスター損傷に起因する変異誘発は一本鎖切断の存在及び配置が大きく影響することが考えられる。

Isolated DNA damages such as single strand break (SSB) and base damage are restored efficiently in cells. It is possible that the non-DSB clustered damage including SSB or base damage contribute to high biological effects, such as mutation. In this study, we investigated the mutagenicity of clustered DNA damage containing SSB and base damage in Escherichia coli. We used plasmid based assay in E. coli to measure the mutation frequency induced by bistranded clustered damage. As a model of clustered damage, we used synthesized oligonucleotides carrying an SSB and/or 8-oxoGs at a restriction enzyme recognition site. Damaged DNA was transfected into E coli and mutation frequency was assessed by the inability to cut by the restriction enzyme. The mutation frequency of clustered damage carrying a 8-oxoG opposite to a second 8-oxoG was the highest in all types of clustered damage tested. However, when a SSB was added to bistranded 8-oxoGs, the mutation frequency became lower in every E. coli strain. These results suggest that SSB located on the same strand to 8-oxoG reduces mutagenic potential of 8-oxoG and that the repair of the SSB or replication is involved in the process. Our studies demonstrate that the mutagenic potential of clustered damage including 8-oxoG depends on existence and position of SSB in clustered damage.