HIV-1プロテアーゼの中性子結晶構造解析

Neutron crystal structure analysis of HIV-1 protease

安達 基泰

Adachi, Motoyasu

本研究では、HIV-1プロテアーゼとその医薬品候補分子との分子間相互作用を原子レベルで解明することを目的として、阻害剤KNI-272との複合体の中性子結晶構造解析を実施した。タンパク質の中性子結晶構造解析を行うには、高品質な大型結晶作成のために大量のタンパク質試料が必要となる。本研究では、コドン(DNA)配列を最適化した人工遺伝子を合成することで効率的な大腸菌発現系を構築し、HIV-1プロテアーゼの大量調製系を確立し、逆相クロマトグラフィーを用いることで自己分解物を完全に除去した純度の高い試料を調製して結晶化を行った。得られた結晶を用いてJAEAのJRR-3に設置しているBIX-4にて中性子回折データを収集した結果、2.3の回折データを得ることができた。プログラムPHENIXにより中性子とX線の同時精密化を実施し、世界で初めてHIV-1プロテアーゼの中性子結晶構造解析に成功した。水素(重水素)原子の存在と位置を確認するためにFo-Fcオミットマップを作成したところ、下図のように顕著な2つのピークを得た。プロトン化された触媒残基(Asp25)及び阻害剤のヒドロキシル基の構造を水素原子を含めて実験で初めて明らかにすることができた。

To understand the mechanism of interaction between HIV-1 protease and its inhibitor KNI-272, we have determined the crystal structure of HIV-1 protease in complex with KNI-272. For neutron crystallography of protein, it is needed to prepare large crystals in size using much amount of purified protein. We have used synthesized DNA optimized to express in E. coli and have purified refolded HIV-1 protease by reverse phase chromatography finally. The diffraction data were collected using BIX-4 at JRR-3 in JAEA. The structure was refined by program PHENIX. Our results indicates that the carbonyl group of allophenylnorstatine (Apns) in KNI-272 forms a significant hydrogen bond with protonated Asp 25, and the hydrogen atom from the hydroxyl group of Apns forms a remarkable hydrogen bond with the deprotonated Asp125. These results show direct evidence that Asp125 provides a proton to carbonyl group of substrate and Asp25 contributes to activate the attacking water molecule as a nucleophile.