プラスミドDNAの変性-アニーリングを利用した多重塩基損傷検出のための新しい方法の開発

A Novel technique using DNA denaturation-annealing to detect multiply induced base lesions in plasmid DNA molecules

横谷 明徳; 鹿園 直哉; 藤井 健太郎

Yokoya, Akinari; Shikazono, Naoya; Fujii, Kentaro

Heイオンビーム等を照射したプラスミドDNAを塩基除去修復酵素(Nth及びFpg)処理すると、グリコシレース活性により生じる付加的な1本鎖切断(SSB)として酸化的塩基損傷が観測され、この収率はLETの増大とともに顕著に減少する(2006年大会)。この理由として、DNA分子上に損傷が局在化(クラスター化)することによるDNA鎖の構造変化が酵素活性を阻害し、見かけ上の塩基損傷収率が減少したためであると考えられる。しかし、このような多重に生じた塩基損傷を検出する実験的手法は現在まだない。そこでわれわれは、2007及び2008年大会で発表した、DNA変性を利用し1本鎖DNAとして鎖切断を定量する新しい非DSB性多重SSBの観測法をさらに発展させ、多重塩基損傷の検出を試みたのでこれを報告する。変性処理後の1本鎖プラスミドDNAを再び5Cで30時間程度アニーリングさせた。この処理によりDNAの両鎖に生成していた多重損傷は、ほとんどの場合元とは別の相補鎖と対合することによりクラスター状態が解消されるため、再びグリコシレースによる塩基除去を受けることができる。講演では、変性/アニールの条件を検討し、実際にX線照射したプラスミドDNAに対して得られた予備的な結果を発表する。

In many studies, base lesions are visualized as additional DNA strand breaks by the enzymatic glycosylase activity. However, these studies do have some limitations of detecting plural base lesions in a clustered base lesion site because the complex damage may retard the enzymatic activity to remove the base lesions. In order to determine the yield of base lesions constituting the clustered lesion site, we have developed a novel technique by which irradiated DNA is analyzed after a denaturation-annealing treatment. The DNA including a clustered base lesion site is denatured to a single strand molecule, and then annealed with a new complementary strand. In the obtained double strand molecule, the clustered base lesion site would be resolved to isolated lesions which are able to be processed by enzymes. We will report the optimal condition of the denaturation-annealing treatment and present a result of preliminary experiment using X-irradiated DNA.