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Structural characteristics of the active site of $$beta$$-Lactamase TOHO-1 determined by combined high-resolution neutron and X-ray crystallography

高分解能中性子/X線結晶構造解析による$$beta$$-ラクタマーゼ活性部位の構造的特性

栗原 和男; 角南 智子; 山田 貢; 似内 靖*; 岡崎 伸生; 安達 基泰; 玉田 太郎; 島村 達郎*; 宮野 雅司*; 石井 良和*; 黒木 良太

Kurihara, Kazuo; Sunami, Tomoko; Yamada, Mitsugu; Nitanai, Yasushi*; Okazaki, Nobuo; Adachi, Motoyasu; Tamada, Taro; Shimamura, Tatsuro*; Miyano, Masashi*; Ishii, Yoshikazu*; Kuroki, Ryota

$$beta$$-ラクタマーゼの活性を議論するため、$$beta$$-ラクタマーゼToho-1・R274N/R276N変異体(Toho-1/NN)結晶(サイズ: 2.6$$times$$2.5$$times$$1.3mm$$^{3}$$)に対してリガンドが結合していない状態の中性子/X線結晶構造解析を高分解能(中性子: 1.5${AA}$, X線: 1.4${AA}$)で行うことに成功した。プログラムPHENIXを用い構造精密化を行った結果(R-factor: 19.7%)、Glu166はLys73のアミノ基(-NH3$$_{+}$$)の正電荷に隣接した位置にもかかわらずpH7においてもプロトン化していることが示された。また、プロトン化したGlu166とSer70・Ser237の主鎖の窒素原子によって形成されるオキシアニオンホールとの間を繋ぐ水和水ネットワークの存在を見いだした。さらに、Glu166とSer70間を繋ぐ触媒水と推定されている水分子の詳細な配置が明らかになった。これらの観察結果は、$$beta$$-ラクタマーゼToho-1の触媒反応機構の理解のために重要である。

To help resolve questions regarding the catalytic activity of $$beta$$-lactamase, the crystal structure of an unliganded form of the $$beta$$-lactamase Toho-1 with double mutation R274N/R276N (Toho-1/NN) has been determined by the use of high-resolution neutron and X-ray diffraction data. A large single crystal of Toho-1/NN with a dimension of 2.6 $$times$$ 2.5 $$times$$ 1.3 mm$$^{3}$$ was used to collect 100 K neutron diffraction data to 1.5 ${AA}$ resolution and X-ray diffraction data to 1.4 ${AA}$ resolution. The structural model of Toho-1/NN was refined to an R-factor of 19.7% using a program PHENIX. The structure showed that Glu166, a catalytic residue of Toho-1, was protonated even at pH 7 nonetheless for the close location to the positively charged side chain amino group (-NH3$$_{+}$$) of Lys73. It is also found that there is a hydration water network bridging between the protonated Glu166 and the oxyanion hole comprising two main chain nitrogen atoms of Ser70 and Ser237. The neutron structure analysis also revealed the clear configuration of the proposed catalytic water molecule bridging Glu166 and Ser70. These observations are important to understand the catalytic action of $$beta$$-lactamase Toho-1.

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