クラスターDNA損傷を含むプラスミドの合成法の開発

The Development of a novel plasmid construction technique for analyzing repair of clustered DNA damage in vivo

高橋 桃子; 鹿園 直哉

Takahashi, Momoko; Shikazono, Naoya

DNAは生体内においてさまざまな要因により損傷を受ける。損傷を受けたDNAが修復されなかった場合、遺伝子の突然変異などさまざまな生物影響を及ぼすことが知られている。これらの生物影響を防ぐために、生体内には多くのDNA修復機構が存在することが知られている。一方、DNAにおいて局所的に複数の損傷が生じたものはクラスターDNA損傷と呼ばれるが、これは放射線によるDNA損傷において特徴的なものの一つであると考えられている。クラスターDNA損傷は修復されにくい損傷であるため突然変異や細胞死の原因となるとされているが、その理由については明らかにされていない。本研究ではクラスターDNA損傷における修復機構を明らかにするために、新規のプラスミド合成法とその解析について検討を行った。開発された方法では、プライマーの任意の位置に損傷を入れることで損傷をデザインすることができる。最終産物を解析した結果、デザインされた損傷は損なわれることなくプラスミドに挿入されていることが確認された。本手法の開発により、細胞内のクラスター損傷のプロセシングに関して重要な知見がもたらされると考えられる。本発表では新規作製法によって合成されるプラスミドを使用したクラスターDNA損傷における修復の解析について、大腸菌を用いた実験を例に議論する。

DNA is damaged by various factors and unrepaired DNA damage would cause alterations of the genome, and thus various biological effects. To avoid these effects, there are diverse mechanisms to repair DNA damage in cells. Clustered DNA damage, defined as two or more lesions in one to two helical turns of DNA, is induced by ionizing radiation. Clustered DNA damage is considered to be refractory to repair and therefore highly lethal and mutagenic. However, the mechanism on how clustered DNA damage causes mutagenesis or lethality is still largely unknown. We constructed lesion-containing plasmids using a novel approach in order to analyze repair of clustered DNA damage. The method introduced by Karata was modified to construct the plasmid. We found that the constructed plasmid DNA had a defined lesion. As DNA lesions could be placed at any position on either strand, the method allows us to construct cluster DNA damage in a plasmid, and would be highly useful in analyzing processing of clustered DNA damage. We will discuss about the analysis of repair of clustered DNA damage in , as an example.