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論文

Structure analysis and derivation of deformed electron density distribution of polydiacetylene giant single crystal by the combination of X-ray and neutron diffraction data

田代 孝二*; 日下 勝弘*; 細谷 孝明*; 大原 高志; 塙坂 真*; 吉澤 功徳*; 山元 博子*; 新村 信雄*; 田中 伊知朗*; 栗原 和男*; et al.

Macromolecules, 51(11), p.3911 - 3922, 2018/06

 パーセンタイル:100(Polymer Science)

The crystal structure of polydiacetylene giant single crystal has been analyzed on the basis of the two different methods of wide-angle neutron diffraction and X-ray diffraction. The X-ray result gives us the total electron density distribution. The neutron result tells the positions of atomic nuclei. As a result, the so-called bonded (or deformed) electron density, i.e., the electron density distribution due to the conjugation among the covalently bonded atoms along the polymer chain, can be estimated using the two information. The present report is the first example of the application of X-N method to the synthetic polymer species.

論文

The Catalytic mechanism of decarboxylative hydroxylation of salicylate hydroxylase revealed by crystal structure analysis at 2.5${AA}$ resolution

上村 拓也*; 喜田 昭子*; 渡邉 佳彦*; 安達 基泰; 黒木 良太; 森本 幸生*

Biochemical and Biophysical Research Communications, 469(2), p.158 - 163, 2016/01

 被引用回数:10 パーセンタイル:31.68(Biochemistry & Molecular Biology)

The X-ray crystal structure of a salicylate hydroxylase from ${it Pseudomonas putida}$ S-1 complexed with coenzyme FAD has been determined to a resolution of 2.5${AA}$. Structural conservation with $$p$$- or $$m$$-hydroxybenzoate hydroxylase is very good throughout the topology, despite a low amino sequence identity of 20-40% between these three hydroxylases. Salicylate hydroxylase is composed of three distinct domains and includes FAD between domains I and II, which is accessible to solvent. In this study, which analyzes the tertiary structure of the enzyme, the unique reaction of salicylate, i.e. decarboxylative hydroxylation, and the structural roles of amino acids surrounding the substrate, are considered.

論文

TRAIL-R2 superoligomerization induced by human monoclonal agonistic antibody KMTR2

玉田 太郎; 新見 大輔*; 池田 昌弘*; 米澤 悌*; 片岡 之郎*; 黒木 良太; 森 英治*; 元木 一宏*

Scientific Reports (Internet), 5, p.17936_1 - 17936_12, 2015/12

 被引用回数:13 パーセンタイル:31.6(Multidisciplinary Sciences)

完全ヒトモノクローナル抗体KMTR2は、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド受容体2(TRAIL-R2)に対して強いアゴニスト単体活性(架橋剤無しでアポトーシス細胞死を誘導)を示す。KMTR2によるアゴニスト単体活性発現メカニズムを明らかにすることを目的として、TRAIL-R2の細胞外領域とKMTR2のFabフラグメント(KMTR2-Fab)の複合体結晶構造を2.1${AA}$分解能で決定した。結晶中において、KMTR2-Fab2分子は結晶学的2回対称に基づき軽鎖のCDR2領域間で会合していたが、この会合がTRAIL-R2重合を促進していると着想した。この着想を実証するために、CDR2間に存在するAsn53をArgに置換した変異体を作製し、種々の機能解析を実施した。その結果、Arg変異体は抗原結合能を保持したまま、アポトーシス誘導活性を失うことが判明した。よって、着想したとおり、結晶学的2回対称に基づくKMTR2の二量体化が核となることでTRAIL-R2の超重合状態が惹起され、腫瘍細胞の細胞死を誘導するアゴニスト活性を発現していることを明らかにした。

論文

Evaluation of the resolvable capacity of Bragg reflections for a new diffractometer at J-PARC/MLF designed for protein crystals with large unit cells

友寄 克亮; 栗原 和男; 玉田 太郎; 黒木 良太

JPS Conference Proceedings (Internet), 8, p.036004_1 - 036004_6, 2015/09

J-PARC/MLFにおいて、250${AA}$格子長をもつ長格子蛋白質結晶の中性子回折データの収集を行うため、飛行時間型の高分解能生体高分子用中性子回折計の建設を計画している。我々は、250${AA}$格子長とd$$_{min}$$=2.0${AA}$の反射をターゲットとしたデータ収集を実現するために、適切な線源として非結合型減速材を選択することとした。必要な中性子フラックスおよびパルス幅を考慮し、我々は、減速材、中性子ガイド、サンプルサイズ、中性子検出器を含む単純な装置モデルを考え、ブラッグ反射の分離性能とJ-PARC/MLFでの長格子蛋白質結晶を対象にした新しい回折計設計のための装置パラメータの評価を行った。長格子蛋白質結晶のブラッグ反射分離には、散乱角の増加とともに全飛行距離の延長することが有効である。一方、中角領域(2$$theta$$$$approx$$90$$^{circ}$$)での分解可能な検出能を確保するためには、角度発散角を制限することが必要になる。減速材とガイド管の見込む最大角$$approx$$0.2$$^{circ}$$の場合、散乱角(2$$theta$$$$approx$$90$$^{circ}$$)から背面バンクの散乱角領域で、格子長250${AA}$を超える蛋白質結晶のd$$_{min}$$=2.0${AA}$の反射が、分離可能となり得ることが分かった。

論文

Nucleoside diphosphate kinase from psychrophilic ${it Pseudoalteromonas}$ sp. AS-131 isolated from Antarctic Ocean

米澤 悌*; 永山 あい子*; 徳永 廣子*; 石橋 松二郎*; 新井 栄揮; 黒木 良太; 渡邉 啓一*; 荒川 力*; 徳永 正雄*

Protein Journal, 34(4), p.275 - 283, 2015/08

 被引用回数:2 パーセンタイル:88.1(Biochemistry & Molecular Biology)

好冷菌${it Pseudoalteromonas}$ sp. AS-131由来ヌクレオシド二リン酸キナーゼ(ASNDK)の大腸菌による発現、および、精製に成功した。通常細菌由来ヌクレオシド二リン酸キナーゼと比較して、ASNDKは、(1)37$$^{circ}$$Cの大腸菌発現では変性した不溶性の状態で発現する。(2)活性の至適温度は30$$^{circ}$$C低い。など、熱的に不安定な特徴を有していた。また、ASNDKは、中度好塩菌由来ヌクレオシド二リン酸キナーゼのような二量体構造を形成することが示唆された。

論文

Insights into the proton transfer mechanism of a bilin reductase PcyA following neutron crystallography

海野 昌喜*; 石川 久美子*; 日下 勝弘*; 玉田 太郎; 萩原 義徳*; 杉島 正一*; 和田 啓*; 山田 太郎*; 友寄 克亮; 細谷 孝明*; et al.

Journal of the American Chemical Society, 137(16), p.5452 - 5460, 2015/04

 被引用回数:14 パーセンタイル:35.42(Chemistry, Multidisciplinary)

シアノバクテリアや高等植物等の光合成生物は細胞内にビリン色素と呼ばれる集光色素を有している。ビリン還元酵素PcyAはビリベルジン(BV)を2段階で還元する反応を触媒することによりビリン色素の1つであるフィコシアノビリンを合成する。今回、我々はシアノバクテリア由来PcyAの立体構造をBVとの複合体状態で中性子結晶解析により決定した。BVは2つの状態(通常の状態と1つ水素が付いたBVH$$^{+}$$の状態)で存在していたが、近接したPcyA中のAsp105もBVの状態に対応して2つの状態(プロトン化および解離状態)で存在していた。また、X線構造解析では照射還元により確認できなかったBV中のA環近くの「アキシアル」水分子の存在を確認することができた。さらに、BV近傍に位置するHis88がプロトン化状態で存在しBV中のA環のラクタム酸素と水素結合を形成していることも確認したが、このHis88と隣接したHis74の間の水分子がH$$_{3}$$O$$^{+}$$の状態で存在することも明らかにした。これらの知見はAsp105, His88および「アキシアル」水分子がPcyAによる触媒反応におけるプロトン移動に関与していることを示唆しており、フィコシアノビリン合成(初期段階)の新たな反応機構の提唱を可能とした。

論文

Structure of a highly acidic $$beta$$-lactamase from the moderate halophile ${it Chromohalobacter}$ sp.560 and the discovery of a Cs$$^{+}$$-selective binding site

新井 栄揮; 米澤 悌*; 岡崎 伸生*; 松本 富美子*; 柴崎 千枝; 清水 瑠美; 山田 貢*; 安達 基泰; 玉田 太郎; 河本 正秀*; et al.

Acta Crystallographica Section D, 71(3), p.541 - 554, 2015/03

 被引用回数:3 パーセンタイル:56.64(Biochemical Research Methods)

蛋白質を利用した希少・有害金属捕集材料の研究開発の一環として、中度好塩菌Chromohalobacter sp.560由来・高酸性$$beta$$-Lactamase(HaBLA)のX線結晶構造を解明するとともに、X線異常分散測定により、HaBLA分子上のCs$$^{+}$$, Sr$$^{2+}$$結合部位の抽出を試みた。PFのNW3AにてHaBLAのX線結晶構造を解明した後、Cs吸収端($$lambda$$=2.175${AA}$)近傍のX線を利用できるSAGA-LSのBL7やPFのBL17A、及び、Sr吸収端($$lambda$$=0.770${AA}$)近傍のX線を利用できるSPring-8のBL38B1やPFのBL5Aなどを使用して、HaBLA分子に結合したCs$$^{+}$$及びSr$$^{2+}$$を同定した。その結果、HaBLA分子上に少なくとも1ヶ所のCs$$^{+}$$結合部位、3ヶ所のSr$$^{2+}$$結合部位を発見した。特に、今回発見したCs$$^{+}$$結合部位は、Na$$^{+}$$がCs$$^{+}$$の9倍量存在する条件下(Na$$^{+}$$/Cs$$^{+}$$ = 90mM/10mM)でもCs$$^{+}$$を選択的に結合できることが明らかになった。このCs$$^{+}$$選択的結合部位は、Trp側鎖のベンゼン環によるカチオン-$$pi$$相互作用、および、主鎖の2つの酸素原子によってCs$$^{+}$$を結合していた。本研究で得たCs$$^{+}$$結合部位の立体構造情報は、原発事故によって放出された放射性Cs$$^{+}$$を捕集する蛋白質材料の設計(人工的Cs$$^{+}$$結合部位の設計)の土台として利用できる。

論文

Structural basis for acceptor-substrate recognition of UDP-glucose: anthocyanidin 3-${it O}$-glucosyltransferase from ${it Clitoria ternatea}$

廣本 武史; 本庄 栄二郎*; 野田 尚信*; 玉田 太郎; 数馬 恒平*; 鈴木 正彦*; Blaber, M.; 黒木 良太

Protein Science, 24(3), p.395 - 407, 2015/03

 被引用回数:19 パーセンタイル:18.95(Biochemistry & Molecular Biology)

チョウマメの花弁に含まれるUDP-glucose: anthocyanidin 3-${it O}$-glucosyltransferase(UGT78K6)は、UDP-glucoseを糖供与体とし、青色色素の基本骨格をなすデルフィニジンへの糖転移を触媒する酵素である。本酵素は、「フラボノール」に類似した化学構造を有するにもかかわらず、デルフィニジンなど「アントシアニジン」特異的な糖転移活性を示す。その糖受容体認識に関わる構造基盤を明らかにするため、UGT78K6単独の立体構造ならびに各糖受容体(アントシアニジンに分類されるデルフィニジンとペチュニジン、またフラボノールの一種であるケンフェロール)が結合した複合体の立体構造をX線結晶構造解析により決定した。今回の研究で見出された糖受容体の結合様式は、これまでに報告されている類似の糖転移酵素(赤ブドウ由来${it Vv}$GT1)とケンフェロールとの結合様式とは全く異なるものであり、発色の異なる糖受容体「アントシアニジン」と「フラボノール」をどのように識別しているのか、その分子メカニズムの解明を可能とした。今後、得られた構造情報を基に糖受容体との相互作用部位を改変することにより、色味の異なる色素化合物の合成あるいは医薬品候補分子の合成を可能にするものと期待される。

論文

トロンボポエチンとトロンボポエチン受容体の構造と作用

黒木 良太; 宮崎 洋*; 加藤 尚志

血液フロンティア, 25(2), p.171 - 180, 2015/02

トロンボポエチンは、巨核球前駆細胞に作用し巨核球の成熟と血小板への分化を促進する液性因子であり、1994年にキリンビールをはじめ複数の研究グループによって発見された。ヒトのトロンボポエチンの全長分子は332のアミノ酸残基からなる糖蛋白質である。アミノ末端側領域は4へリックスバンドル構造を取り、受容体c-Mplと結合する相互作用部位を2か所もつ。トロンボポエチン1分子と受容体2分子が会合して細胞内シグナル伝達系の活性化が生じると推定される。トロンボポエチン受容体作動薬ロミプロスチムとエルトロンビパグは、内因性トロンボポエチンとは全く異なる構造をもつが、c-Mplと結合して生物活性を発揮する。

論文

広角X線回折および広角中性子回折に基づく高分子結晶構造の精密解析

田代 孝二*; 塙坂 真*; 山元 博子*; Wasanasuk, K.*; Jayaratri, P.*; 吉澤 功徳*; 田中 伊知朗*; 新村 信雄*; 日下 勝弘*; 細谷 孝明*; et al.

高分子論文集, 71(11), p.508 - 526, 2014/11

 被引用回数:3 パーセンタイル:79.68(Polymer Science)

高分子結晶構造の詳細を、水素原子位置まで含めて明らかにすることを目的とし、高エネルギーX線および中性子回折データの収集ならびにそれらの解析結果を、さまざまの結晶性高分子を例として総合的に記述した。まず、最近にまで至る高分子構造解析手法の発展について概要を述べるとともに、それらの各段階における問題点について考察した。斜方晶型ポリエチレン、アタクティックポリビニルアルコール、ポリ乳酸およびそのステレオコンプレックスなど、いろいろの意味で重要な高分子について、これまでに提案されてきた構造を再吟味するとともに、新たに提案した構造について記述した。水素原子位置についても精確に決定された場合は、それらの構造情報に基づく極限力学物性の定量的予測を行った。さらにはポリジアセチレンの場合について、X線および中性子構造解析によって得られた精密な電子密度分布および原子位置座標の情報にいわゆるX-N法を適用し、主鎖骨格に沿った結合電子密度分布についての導出についても言及した。構造物性相関解明における高分子結晶構造解析の今後の展開についても言及した。

論文

Interaction of double-stranded DNA with polymerized PprA protein from ${it Deinococcus radiodurans}$

安達 基泰; 平山 裕士; 清水 瑠美; 佐藤 勝也; 鳴海 一成*; 黒木 良太

Protein Science, 23(10), p.1349 - 1358, 2014/10

 被引用回数:7 パーセンタイル:63.85(Biochemistry & Molecular Biology)

DNAの修復に関与する多機能なPprAは、デイノコッカスラジオデュランスの高度な放射線耐性を促進する重要なタンパク質である。PprAによる放射線耐性機構を解明するために、大腸菌で発現した組換え型PprAと2本鎖DNAとの相互作用解析を実施した。ゲルシフトアッセイにより、PprAとスーパーコイル型のpUC19 DNAとの複合体のゲルシフトが2極性であり、それが1mMのMg, Ca, Srイオンで促進されることが示された。シフトしたバンドの相対的な割合からPprAとスーパーコイル型のpUC19 DNAとの複合体形成のヒル係数および解離定数を計算したところ、1mM Mgイオンの存在下で、それぞれ3.3と0.6$$mu$$Mであった。このことは、PprAがスーパーコイル型のpUC19 DNAに少なくとも281分子結合していることを示しており、ゲル濾過での分離後にUV吸収で見積もられた値と一致した。この結果は、PprAが2本鎖DNAに沿って、直鎖状に重合して結合していることを示唆している。一方で、直鎖状の2本鎖DNAとニックがある環状DNAのバンドシフトに関しては、飽和が見られず、1.3$$mu$$M以上のPprA濃度の時、さらに大きな複合体の形成が確認された。この結果は、DNAに結合したPprAが、ダメージを受けたDNAの末端の会合を濃度依存的に促進していることを示している。

論文

タンパク質に新しい機能を与える

黒木 良太

進化を続ける構造生物学; 新たなタンパク質機能の解明と創出, p.93 - 109, 2014/09

タンパク質に期待される新しい力には、新規な反応生成物創製、触媒活性の加速、より高度な分子認識などが考えられる。X線結晶回折法を初めとする精密な立体構造解析手法により、タンパク質に新しい力を付与するための具体的な方策が得られる。本章では立体構造に基づいてタンパク質へのさまざまな新機能を付与した例を示し、立体構造情報を土台としたタンパク質工学の重要性を述べたい。さらに、水素原子を含む全原子の座標情報を得ることができる中性子解析や、立体構造情報を得るためのタンパク質工学による結晶化手法についても紹介する。

論文

中性子回折法による創薬標的タンパク質の立体構造解析

黒木 良太

日本の結晶学,2; その輝かしい発展, P. 392, 2014/07

創薬標的タンパク質と医薬品候補分子の相互作用を正確に予想するには、まず両者の相互作用様式を精密に解析し、知見を蓄積する必要がある。相互作用様式を具体的に知る効果的な手法の1つはX線構造解析であるが、結合部位にあらかじめ存在する水和構造や無機イオンとの相互作用情報を知るには、X線回折法と水素原子の検出を得意とする中性子回折法を相補的に用いることが効果的である。研究原子炉からの中性子ビームは、タンパク質の立体構造を解析できる唯一のビームラインであったが、近年稼働を開始しエネルギー増強中のJ-PARCでは、産業利用目的の茨城県生命物質解析装置(iBIX)を用いたタンパク質の立体構造解析も報告され始めた。中性子結晶回折法を用いたタンパク質の立体構造解析は、タンパク質が担う生物浮化学反応や分子認識メカニズムの解明に大きな貢献が期待されている。それらを一刻も早く実現するために、われわれはJ-PARCに、研究者の共同利用を目的としたタンパク質構造解析専用のパルス中性子回折装置の建設を目指している。

論文

Structural characteristics of alkaline phosphatase from the moderately halophilic bacterium ${it Halomonas}$ sp.593

新井 栄揮; 米澤 悌*; 石橋 松二郎*; 松本 富美子*; 安達 基泰; 玉田 太郎; 徳永 廣子*; Blaber, M.; 徳永 正雄*; 黒木 良太

Acta Crystallographica Section D, 70(3), p.811 - 820, 2014/03

 被引用回数:4 パーセンタイル:53.34(Biochemical Research Methods)

中度好塩菌${it Halomonas}$ sp.593のペリプラズム蛋白質Alkaline phosphatase(HaAP)は、他の好塩性Alkaline phosphataseと異なり、幅広い塩濃度域(1$$sim$$4M NaCl)において機能発現が可能である。そこで本研究では、HaAPの構造学的特徴と好塩性の関係を理解するために、HaAPのX線結晶解析を行った。分解能2.1${AA}$, 空間群${it P}$2$$_{1}$$, 格子定数${it a}$=52.7${AA}$, ${it b}$=147.0${AA}$, ${it c}$=58.3${AA}$, $$alpha$$=90$$^{circ}$$, $$beta$$=105.2$$^{circ}$$, $$gamma$$=90$$^{circ}$$, R$$_{merge}$$ 8.4%の回折データを取得して、生物学的構造単位であるHaAP二量体の立体構造を解明することに成功した。また、HaAPの立体構造を、PDB中で最も配列相同性が高い低度好塩菌${it Vibrio}$ sp.由来VAP(identity 70.0%)の立体構造と比較した。その結果、ASA$$>$$0${AA}$ $$^{2}$$の酸性アミノ酸(D, E)の数は、VAP(57個)よりもHaAP(72個)が多いことが明らかになった。また、VAPとHaAPを構成する疎水性アミノ酸(V, L, I, P, F, M, W)に着目すると、二量体界面に位置する疎水性アミノ酸の数はほぼ同じ(39個と40個)であったが、分子内部(ASAが0${AA}$)の疎水性アミノ酸はそれぞれ24個と37個であった。このようなHaAPにおける分子表面の高い酸性アミノ酸含量や分子内部の高い疎水性アミノ酸含量は、中度好塩菌のペリプラズム特有の幅広い塩濃度環境下(0.5M$$sim$$飽和塩濃度)における高い可溶性と機能発現の両立に寄与していると考えられる。

論文

生体分子の中性子単結晶回析,3; タンパク質中性子結晶構造解析の実例と応用

安達 基泰; 新井 栄揮; 廣本 武史; 黒木 良太

波紋, 24(1), p.45 - 49, 2014/02

中性子回折を使った蛋白質の構造解析は、生体高分子の構造と機能の関係を理解する上においてますます重要になっている。原子力機構の研究用原子炉およびパルス中性子施設に設置した中性子回折計の近年の発達したことによって、水和水と生体高分子の水素原子を観察することが可能となり、化学反応の機構を解明するための重要な知見が得られるようになった。ここでは、生体高分子の中性子結晶構造解析のための、試料調製、結晶成長、構造解析と得られる情報の利用について例を挙げ概説する。

論文

High-resolution crystal structure of copper amine oxidase from ${it Arthrobacter globiformis}$; Assignment of bound diatomic molecules as O$$_{2}$$

村川 武志*; 林 秀行*; 角南 智子; 栗原 和男; 玉田 太郎; 黒木 良太; 鈴木 守*; 谷澤 克行*; 岡島 俊英*

Acta Crystallographica Section D, 69(12), p.2483 - 2494, 2013/12

 被引用回数:8 パーセンタイル:35.2(Biochemical Research Methods)

アルスロバクター-グロビフォルミス由来銅アミン酸化酵素の結晶構造を抗凍結剤として低分子ポリエチレングリコール(LMW PEG; 平均分子量$$sim$$200)を用いて1.08${AA}$分解能で決定した。最終的な結晶構造学的$$R$$因子と$$R$$$$_{rm free}$$値は、それぞれ13.0%と15.0$$%$$であった。LMW PEGの幾つかの分子は、活性部位を含むタンパク質内部の空洞を占めており、それが分子全体の温度因子の著しい低下をもたらし、結果として、単量体分子量が約70,000と比較的大きなタンパク質にも拘わらず原子分解能の構造に至ったことがわかった。推定される全水素原子の約40%は、$$F$$$$_{rm o}$$-$$F$$$$_{rm c}$$差図中に明確な電子密度を持って観察され、複数のマイナーな配座異性体も多くの残基に対して同定された。また、翻訳後に誘導されたキノン補因子と銅原子を含む活性部位における異方的な変位の揺らぎを見積った。さらに、複数の二原子分子、恐らく分子性酸素がタンパク質と結合し、そのうちの一つは二量体界面の中央に位置する空洞から活性部位まで基質である二原子酸素のための進入経路として以前から提案されている領域に位置していた。

論文

Elucidations of the catalytic cycle of NADH-cytochrome $$b$$$$_{5}$$ reductase by X-ray crystallography; New insights into regulation of efficient electron transfer

山田 貢*; 玉田 太郎; 竹田 一旗*; 松本 富美子*; 大野 拓*; 小杉 正幸*; 高場 圭章*; 正山 祥生*; 木村 成伸*; 黒木 良太; et al.

Journal of Molecular Biology, 425(22), p.4295 - 4306, 2013/11

 被引用回数:14 パーセンタイル:44.93(Biochemistry & Molecular Biology)

NADHシトクロム$$b$$$$_{5}$$還元酵素(b5R)はNADHドメインとFADドメインの2つのドメインからなるフラボタンパク質で、NADHから二個の電子を受け取り、二分子のシトクロム$$b$$$$_{5}$$(Cb5)に一電子ずつ伝達する反応を触媒する。今回、ブタ肝臓由来b5Rの還元型および酸化型の両状態における結晶構造解析に成功した。嫌気環境下で作製した結晶を用いて1.68${AA}$分解能で解析した二電子還元型b5Rの構造は、酸化型と比較して2つのドメインの相対配置がわずかに変化しており、その結果、FADの溶媒露出面積が増大し、FADのイソアロキサジン環のN5原子と、FADからのプロトン放出に関わっていると考えられているThr66の側鎖の水酸基間に水素結合が形成していた。一方、イソアロキサジン環の平面性は、還元型においても酸化型と変わらず保持されており、NAD$$^{+}$$のニコチンアミド環とスタッキングしていた。また、0.78${AA}$分解能で解析した酸化型b5Rの構造から、Thr66を介したFADとHis49間の水素結合ネットワークが水素原子の位置情報と共に明らかになった。これらの構造的特徴は、b5Rの触媒サイクルにおいて、電子の逆流を防ぎ、Cb5のような電子受容体への電子移動を促進するものであった。さらに、クライオトラップ法により還元型結晶の大気暴露時間を制御し作製した結晶を用いた解析により、還元型から酸化型への再酸化反応は二段階を経ることが示唆された。

論文

Creation and structure determination of an artificial protein with three complete sequence repeats

安達 基泰; 清水 瑠美; 黒木 良太; Blaber, M.

Journal of Synchrotron Radiation, 20(6), p.953 - 957, 2013/11

 被引用回数:2 パーセンタイル:81.05(Instruments & Instrumentation)

Symfoil-4Pは、ヒト酸性繊維芽細胞増殖因子を基に設計した3回対称なベータトレフォイル構造をもつ人工タンパク質である。脱アミド反応を防ぐためにアスパラギン-グリシン配列を除去した変異体Symfoil-QGおよびSymfoil-SGを作製し、さらにSymfoil-QGにHisTagを付加したものをHis-Symfoil-IIとした。His-Symfoil-IIは、プロテアーゼ処理によりHisTagを除去することで、完全な3回繰り返し配列をもつことになる。各タンパク質は、大腸菌内で可溶性タンパク質として発現し、Niカラムにより精製した。Symfoil-IIについては、HisTagをプロテアーゼ処理により除去した後に陰イオン交換カラムを用いて精製した。Symfoil-QGとSymfoil-IIをそれぞれ、1.5および1.1${AA}$分解能で結晶構造解析した。精密化したSymfoil-IIは、他のSymfoilと同等に疑似3回軸を持っていることが示された。

論文

Crystal structure of UDP-glucose:anthocyanidin 3-${it O}$-glucosyltransferase from ${it Clitoria ternatea}$

廣本 武史; 本庄 栄二郎*; 玉田 太郎; 野田 尚信*; 数馬 恒平*; 鈴木 正彦*; 黒木 良太

Journal of Synchrotron Radiation, 20(6), p.894 - 898, 2013/11

 被引用回数:23 パーセンタイル:14.15(Instruments & Instrumentation)

チョウマメの花弁には、テルナチンと呼ばれるポリアシル化アントシアニンが含まれている。その生合成の最初の段階を担うのがUDP-グルコース:アントシアニジン3-${it O}$-グルコシルトランスフェラーゼ(${it Ct}$3GT-A)であり、UDP-グルコースを糖供与体とし、糖受容体であるアントシアニジン類への糖転移反応を触媒する。ここでは${it Ct}$3GT-Aの構造機能相関を明らかにするため、${it Ct}$3GT-Aの大腸菌組換え体を調製し、その立体構造をX線結晶構造解析により1.85${AA}$分解能で決定した。その全体構造は、2つのRossmann-like $$beta$$/$$alpha$$/$$beta$$ドメインから成るGT-Bフォールドを有しており、また2つのドメイン間に形成されたクレフトには、糖供与体(UDP-Glc)および糖受容体を結合するキャビティが存在していた。既に報告されている赤ブドウ由来フラボノイド3-${it O}$-グリコシルトランスフェラーゼ(${it Vv}$GT1)との構造比較より、糖受容体であるケンフェロールの結合に関与するアミノ酸残基が${it Ct}$3GT-Aにおいて有意に置換されていることが明らかとなった。これらの知見は、両酵素の糖受容体特異性の差別化を理解する上で重要と考えられる。

論文

Neutron and X-ray crystallographic analysis of the human $$alpha$$-thrombin-bivalirubin complex at pD 5.0; Protonation states and hydration structure of the enzyme-product complex

山田 太郎*; 栗原 和男; 大西 裕季*; 玉田 太郎; 友寄 克亮; 桝見 賢司*; 田中 伊知朗*; 黒木 良太; 新村 信雄*

Biochimica et Biophysica Acta; Proteins and Proteomics, 1834(8), p.1532 - 1538, 2013/08

 被引用回数:5 パーセンタイル:76.43(Biochemistry & Molecular Biology)

$$alpha$$-トロンビン-ビバリルジン複合体のプロトン化状態と水和構造をX線(1.6${AA}$)/中性子(2.8${AA}$)単結晶回折データによる同時構造精密化により明らかにした。原子間距離については別途、1.25${AA}$のX線結晶構造解析により評価した。この複合体は、$$alpha$$-トロンビンの酵素・生成物(EP)複合体のモデルとなる。活性化部位周囲の中性子散乱長図は、H57/Hの側鎖が重水素化されていることを示唆する。この同時精密化により、H57/HのD$$delta$$1とD$$epsilon$$2の占有率がそれぞれ1.0と0.7であると示された。しかしながら、S195/Hのヒドロキシル基のO$$gamma$$周囲には有意な中性子散乱長密度が観察されなかった。また、そのO$$gamma$$は、dFPR-COOHのカルボキシル基炭素に近接していた。これらの観察から、S195/HのO$$gamma$$は脱プロトン化されており、EP複合体において求核性を維持していると示唆された。また、活性化部位に加えて、ビバリルジンの認識に関与するS1サブサイトとエキソサイトIに水和構造が存在することが分かった。

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