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論文

Interaction of double-stranded DNA with polymerized PprA protein from ${it Deinococcus radiodurans}$

安達 基泰; 平山 裕士; 清水 瑠美; 佐藤 勝也; 鳴海 一成*; 黒木 良太

Protein Science, 23(10), p.1349 - 1358, 2014/10

 被引用回数:9 パーセンタイル:25.73(Biochemistry & Molecular Biology)

DNAの修復に関与する多機能なPprAは、デイノコッカスラジオデュランスの高度な放射線耐性を促進する重要なタンパク質である。PprAによる放射線耐性機構を解明するために、大腸菌で発現した組換え型PprAと2本鎖DNAとの相互作用解析を実施した。ゲルシフトアッセイにより、PprAとスーパーコイル型のpUC19 DNAとの複合体のゲルシフトが2極性であり、それが1mMのMg, Ca, Srイオンで促進されることが示された。シフトしたバンドの相対的な割合からPprAとスーパーコイル型のpUC19 DNAとの複合体形成のヒル係数および解離定数を計算したところ、1mM Mgイオンの存在下で、それぞれ3.3と0.6$$mu$$Mであった。このことは、PprAがスーパーコイル型のpUC19 DNAに少なくとも281分子結合していることを示しており、ゲル濾過での分離後にUV吸収で見積もられた値と一致した。この結果は、PprAが2本鎖DNAに沿って、直鎖状に重合して結合していることを示唆している。一方で、直鎖状の2本鎖DNAとニックがある環状DNAのバンドシフトに関しては、飽和が見られず、1.3$$mu$$M以上のPprA濃度の時、さらに大きな複合体の形成が確認された。この結果は、DNAに結合したPprAが、ダメージを受けたDNAの末端の会合を濃度依存的に促進していることを示している。

口頭

メタノール資化酵母を用いたインフルエンザノイラミニダーゼの発現および精製

平山 裕士; 安達 基泰; 清水 瑠美; 黒木 良太

no journal, , 

ノイラミニダーゼは、インフルエンザウイルスが宿主細胞から遊離する際に、宿主の糖タンパク質のシアル酸を切断する酵素である。ノイラミニダーゼは、分子内に8個のSS結合を持ち、真核生物分泌発現系での発現が望ましい。そこで我々は、鳥インフルエンザノイラミニダーゼをメタノール資化酵母(GS115)で発現させることを試みた。まず酵母発現系に最適化した鳥インフルエンザノイラミニダーゼの遺伝子を化学合成し、同時に精製を容易にするためのN末端にヒスチジンタグの付加、および化学的安定性の向上を目的として分子表面にあるシステイン(C161)をセリンへ置換(His-C161Sノイラミニダーゼ)した。His-C161Sノイラミニダーゼは酵母で大量(培地1Lあたり約60mg)に発現したが、N型糖鎖付加配列に変異導入した糖鎖欠損変異体(N88R/N146R/N235R)は、培養上清には発現しなかった。このことは、ノイラミニダーゼの発現に糖鎖付加が不可欠であることを示唆する。培養上清を回収後、4Mグアニジン塩酸塩により変性させ、Niカラムにより精製した。得られた試料を透析によって再生後陰イオン交換樹脂で精製した。精製試料は、基質fetuinに対して約200U/mgの活性を示し、機能を保持していることを確認した。メタノール資化酵母による発現は、試料の完全重水素化にも有利であり、中性子構造解析を目的とした鳥インフルエンザノイラミニダーゼの完全重水素化が次の課題である。

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