検索対象:     
報告書番号:
※ 半角英数字
 年 ~ 
 年
検索結果: 21 件中 1件目~20件目を表示

発表形式

Initialising ...

選択項目を絞り込む

掲載資料名

Initialising ...

発表会議名

Initialising ...

筆頭著者名

Initialising ...

キーワード

Initialising ...

使用言語

Initialising ...

発行年

Initialising ...

開催年

Initialising ...

選択した検索結果をダウンロード

論文

Elucidations of the catalytic cycle of NADH-cytochrome $$b$$$$_{5}$$ reductase by X-ray crystallography; New insights into regulation of efficient electron transfer

山田 貢*; 玉田 太郎; 竹田 一旗*; 松本 富美子*; 大野 拓*; 小杉 正幸*; 高場 圭章*; 正山 祥生*; 木村 成伸*; 黒木 良太; et al.

Journal of Molecular Biology, 425(22), p.4295 - 4306, 2013/11

 被引用回数:20 パーセンタイル:48.97(Biochemistry & Molecular Biology)

NADHシトクロム$$b$$$$_{5}$$還元酵素(b5R)はNADHドメインとFADドメインの2つのドメインからなるフラボタンパク質で、NADHから二個の電子を受け取り、二分子のシトクロム$$b$$$$_{5}$$(Cb5)に一電子ずつ伝達する反応を触媒する。今回、ブタ肝臓由来b5Rの還元型および酸化型の両状態における結晶構造解析に成功した。嫌気環境下で作製した結晶を用いて1.68${AA}$分解能で解析した二電子還元型b5Rの構造は、酸化型と比較して2つのドメインの相対配置がわずかに変化しており、その結果、FADの溶媒露出面積が増大し、FADのイソアロキサジン環のN5原子と、FADからのプロトン放出に関わっていると考えられているThr66の側鎖の水酸基間に水素結合が形成していた。一方、イソアロキサジン環の平面性は、還元型においても酸化型と変わらず保持されており、NAD$$^{+}$$のニコチンアミド環とスタッキングしていた。また、0.78${AA}$分解能で解析した酸化型b5Rの構造から、Thr66を介したFADとHis49間の水素結合ネットワークが水素原子の位置情報と共に明らかになった。これらの構造的特徴は、b5Rの触媒サイクルにおいて、電子の逆流を防ぎ、Cb5のような電子受容体への電子移動を促進するものであった。さらに、クライオトラップ法により還元型結晶の大気暴露時間を制御し作製した結晶を用いた解析により、還元型から酸化型への再酸化反応は二段階を経ることが示唆された。

論文

Structure and function of $$Delta$$1-tetrahydrocannabinolic acid (THCA) synthase, the enzyme controlling the psychoactivity of ${it Cannabis sativa}$

正山 祥生*; 玉田 太郎; 栗原 和男; 竹内 彩子*; 田浦 太志*; 新井 栄揮; Blaber, M.*; 正山 征洋*; 森元 聡*; 黒木 良太

Journal of Molecular Biology, 423(1), p.96 - 105, 2012/10

 被引用回数:79 パーセンタイル:89.33(Biochemistry & Molecular Biology)

$$Delta$$1-テトラヒドロカンナビノール酸(THCA)合成酵素は、基質であるカンナビゲロール酸の酸化的閉環反応を触媒し、大麻の幻覚活性をつかさどる$$Delta$$1-テトラヒドロカンナビノールの前駆体であるTHCAを合成する。本研究では、THCA合成酵素のX線結晶解析及び変異体を用いた活性測定を実施し、THCA合成酵素の機能-構造相関の解明を試みた。2.75${AA}$分解能で決定した立体構造情報に変異体解析結果を組合せことにより、THCA合成酵素の活性に寄与する残基を同定した。

論文

Structure of HIV-1 protease in complex with potent inhibitor KNI-272 determined by high-resolution X-ray and neutron crystallography

安達 基泰; 大原 高志; 栗原 和男; 玉田 太郎; 本庄 栄二郎; 岡崎 伸生; 新井 栄揮; 正山 祥生; 木村 要*; 松村 浩由*; et al.

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 106(12), p.4641 - 4646, 2009/03

 被引用回数:111 パーセンタイル:90.76(Multidisciplinary Sciences)

本研究では、プロテアーゼとその医薬品候補分子との分子間相互作用を原子レベルで解明することを目的として、阻害剤との複合体の中性子結晶構造解析を実施した。タンパク質の中性子結晶構造解析を行うには、高品質な大型結晶作成のために大量のタンパク質試料が必要となる。本研究では、コドン配列を最適化した人工遺伝子を合成することで効率的な大腸菌発現系を構築し、プロテアーゼの大量調製系を確立した。そして逆相クロマトグラフィーを用いることで自己分解物を完全に除去した純度の高い試料を調製して結晶化を行った。得られた結晶を用いてJRR-3に設置しているBIX-4にて中性子回折データを収集した結果、1.9${AA}$の回折データを得ることができた。プログラムPHENIXにより中性子とX線の同時精密化を実施し、世界で初めてHIV-1プロテアーゼの中性子結晶構造解析に成功した。重水素原子の存在と位置を確認するためにオミットマップを作成したところ、顕著な2つのピークを得た。プロトン化された触媒残基及び阻害剤のヒドロキシル基の構造を水素原子を含めて実験で初めて明らかにすることができた。

論文

Expression of the extracellular region of the human interleukin-4 receptor $$alpha$$ chain and interleukin-13 receptor $$alpha$$1 chain by a silkworm-baculovirus system

本庄 栄二郎; 正山 祥生; 玉田 太郎; 重松 秀樹*; 畠中 孝彰*; 金地 佐千子*; 有馬 和彦*; 伊東 祐二*; 出原 賢治*; 黒木 良太

Protein Expression and Purification, 60(1), p.25 - 30, 2008/07

 被引用回数:13 パーセンタイル:33.75(Biochemical Research Methods)

インターロイキン-13に対する受容体はインターロイキン-13$$alpha$$1鎖及びインターロイキン-4$$alpha$$鎖からなる。これらの相互作用を調べるため、IL-13受容体$$alpha$$1鎖及びIL-4受容体$$alpha$$鎖細胞外領域をコードするDNAをマウスIgGのFcと融合体としてカイコ/バキュロウイルス系で発現した。受容体はプロテインAカラムを用いて回収し、トロンビン消化でFcと切り離すことができた。ゲルろ過やSPR分析の結果、IL-13とIL-13受容体$$alpha$$1鎖複合体はIL-4受容体$$alpha$$と結合したが、IL-13やIL-13受容体$$alpha$$1鎖単独でのIL-4受容体$$alpha$$との相互作用は見られなかった。これらの結果から、IL-13はIL-13受容体$$alpha$$1と相互作用し、さらにIL-4受容体$$alpha$$と結合することが明らかとなった。

論文

Crystallization and preliminary X-ray diffraction studies of polyketide synthase-1 (PKS-1) from ${it Cannabis sativa}$

田口 千穂; 田浦 太志*; 玉田 太郎; 正山 祥生; 正山 征洋*; 田中 宏幸*; 黒木 良太; 森元 聡*

Acta Crystallographica Section F, 64(3), p.217 - 220, 2008/03

 被引用回数:3 パーセンタイル:36.12(Biochemical Research Methods)

Polyketide synthase-1 (PKS-1) is a novel type III polyketide synthase that catalyzes biosynthesis of the hexanoyl triacetic acid lactone in ${it Cannabis sativa}$ (Mexican strain). PKS-1 was overproduced in ${it Escherichia coli}$, purified and finally crystallized in two different space groups. The crystal obtained in 0.1 M HEPES buffer (pH 7.5) containing 0.2 M calcium acetate and 20% (w/v) polyethylene glycol 3350, diffracted to 1.65 ${AA}$ resolution and belonged to space group ${it P}$1 with unit-cell parameters of a = 54.3 ${AA}$, b = 59.3 ${AA}$, c = 62.6 ${AA}$, ${it $alpha$}$ = 69$$^{circ}$$, ${it $beta$}$ = 81$$^{circ}$$, ${it $gamma$}$ = 80$$^{circ}$$. Another crystal obtained in 0.1 M HEPES buffer (pH 7.5) containing 0.2 M sodium chloride and 20% (w/v) polyethylene glycol 3350, diffracted to 1.55 ${AA}$ resolution and belonged to the space group ${it P}$2$$_{1}$$2$$_{1}$$2$$_{1}$$ with unit-cell parameters of a = 54.3 ${AA}$, b = 110 ${AA}$, c = 130 ${AA}$. These data will enable us to determine the crystal structure of PKS-1.

口頭

THCA合成酵素のX線結晶構造

正山 祥生*; 竹内 彩子*; 田浦 太志*; 正山 征洋*; 安達 基泰; 玉田 太郎; 黒木 良太

no journal, , 

THCA合成酵素は基質のcannabigerolic acid(CBGA)を酸化的に閉環する反応を触媒する酸化酵素である。THCA合成酵素の活性部位を明確にし、THCA生成の反応メカニズムを原子レベルで解明することを目的として、X線結晶構造の解明を試みた。THCA合成酵素はcDNAを昆虫細胞で発現させた後、陰イオン交換樹脂を用いて精製を行った。次いで結晶化条件を検討し、0.09M HEPES pH7.5, 1.26M sodium citrateの溶液中で結晶化させることに成功した。そしてSPring-8のビームライン(BL41XU)を用いて、2.8$AA $の分解能回折でデータを得た。位相決定は、最近X線結晶構造が報告されたoligoglucosaccharide oxidaseをモデル構造として分子置換法を用いた。Native結晶の反射データから電子密度を計算し、精密化を行い立体構造解析を行った。FADの周辺では1個のTyr残基が認められ、これがbaseとしてCBGAからprotonを引き抜き、補酵素のFADがhydrideを受け取ると考えられる。このTyrをPheに変換した変異酵素が、THCA生成能を完全に欠損することを確認した。さらに活性部位の構造を詳細に解析することにより、閉環反応を制御するメカニズムを解明する予定である。

口頭

THCA合成酵素のX線結晶構造

正山 祥生; 玉田 太郎; 竹内 彩子*; 田浦 太志*; 安達 基泰; 正山 征洋*; 黒木 良太; 森元 聡*

no journal, , 

THCA合成酵素は、大麻の幻覚活性を司るTHCAの生産を制御する酵素であり、基質となるCBGAを酸化的に閉環しTHCAを合成する。THCA合成酵素の反応メカニズムを解明するため、本酵素を昆虫細胞によって分泌発現させ、目的酵素試料を調製した。この試料を用いて結晶化条件を検討したところ、タンパク質濃度20mg/mL, 0.1M HEPES緩衝液pH7.5, 1.3Mクエン酸ナトリウム塩の条件で結晶化に成功した。得られた結晶を用いてX線回折実験を行ったところ、本結晶は空間群P432に属し、格子長a=b=c=179であり2.8$AA $分解能の回折データを得た。この回折データを用いて、アミノ酸配列に23%の相同性を有すGlucooligosaccharide Oxidaseの立体構造を用いて、分子置換法による解析を行い、得られた解をもとに初期モデルを構築し、精密化を行った。最終的に立体構造モデルをR-factor19.6%(R free 24.2%)まで精密化した。得られた構造情報をもとに活性部位の検討を行い、部位特異的変異導入によってTyr-484が活性に重要な残基であることを明らかにした。これらの知見から、THCA合成酵素の反応メカニズムについて考察した。

口頭

大麻ポリケタイド合成酵素の大腸菌発現及び精製

田口 千穂*; 田浦 太志*; 森元 聡*; 正山 祥生; 玉田 太郎; 黒木 良太; 正山 征洋*

no journal, , 

大麻はカンナビノイドと称される二次代謝産物を生産し、これら化合物は多発性硬化症など種々の難治性疾患に著効を示すことから医学生物学的に極めて高い注目を集めている。カンナビノイドの基本骨格はポリケタイドに由来することから、大麻ポリケタイド合成酵素はカンナビノイドの大量生産などバイオテクノロジーへの応用が期待されるキーエンザイムである。われわれは先に、大麻ポリケタイド合成酵素の大麻からのクローニングを検討し、PKS-1と称する新規酵素のcDNAを得た。次いで大腸菌での発現に成功し、組換え酵素の活性を検討したところ、PKS-1は基質特異性及び反応性の両面において既知の植物ポリケタイド合成酵素と異なる新規性の高い酵素であることを明らかにした。さらに、PKS-1の基質特異性及び酵素反応メカニズムを決定している立体構造的基盤を明らかにするため、結晶構造解析を目的として本酵素の大量発現を行うとともに、Niアフィニティーカラム及びイオン交換カラムによる精製法を確立した。この試料を用いて結晶化条件検討を行い、複数の条件で針状結晶を得ることに成功した。

口頭

Crystal structure of Delta1-tetrahydrocannabinolic acid synthase from ${it Cannabis sativa}$

正山 祥生; 玉田 太郎; 竹内 彩子*; 田浦 太志*; 正山 征洋*; 黒木 良太; 森元 聡*

no journal, , 

THCA synthase is the enzyme that catalyzes oxidative cyclization of cannabigerolic acid into THCA, the precursor of Delta1-tetrahydrocannabinol. In order to investigate the structure-function relationship of THCA synthase, this enzyme was overproduced in insect cells, purified and finally crystallized in 0.1 M HEPES buffer pH 7.5 containing 1.4 M sodium citrate. A single crystal suitable for X-ray diffraction measurement was obtained in 0.09 M HEPES buffer pH 7.5 containing 1.26 M sodium citrate. The crystal diffracted to 2.8 ${AA}$ resolution at beamline BL41XU, SPring-8. The crystal belonged to the primitive cubic space group P432, with unit-cell parameters a=b=c=178.2 ${AA}$. R value of the structure model was 19.6%. Active site of THCA synthase was investigated by mutation analysis using the structural information from X-ray crystallography. It was found that Tyr484 was identified to be one of the important residues in activity of THCA synthase.

口頭

抗体を用いた分泌性タンパク質の機能及び構造解析

玉田 太郎; 新井 栄揮; 正山 祥生; 本庄 栄二郎; 黒木 良太

no journal, , 

タンパク質の立体構造情報が集積される一方で、受容体のような膜タンパク質の構造情報は遅れがちである。細胞の表層に発現する受容体は、創薬における重要な標的であることが知られるが、その多くは一般的に不安定でプロテアーゼ消化されやすく、付加した糖鎖による不均一性から構造解析の対象となりにくかった。そこでわれわれはこれらのタンパク質を効果的に結晶化させるため、抗体、特にFabフラグメントとの共結晶化研究を行っている。Fabとの共結晶化では、複合体化による目的タンパク質の安定化,Fab分子による目的タンパク質の結晶化促進,既知のFab構造の位相情報を利用した迅速な構造決定などが期待できる。さらに抗体自身は医薬品や診断薬としての重要な用途があるため、抗原のエピトープ決定や抗体の高機能化などにおいて産業応用面においても重要な研究である。本発表ではわれわれの抗体を用いた結晶化研究で得られたさまざまな知見について紹介する。

口頭

中性子構造解析を目的としたNADH-チトクロームb5Rの結晶化

正山 祥生; 玉田 太郎; 黒木 良太; 木村 成伸*; 竹田 一旗*; 林 拓郎*; 三木 邦夫*

no journal, , 

NADH-チトクロームb5還元酵素(b5R)は、FADを持つピリジンヌクレオチド酵素でNADHからcytochrome b5への電子伝達を触媒する酵素である。b5Rは、脂肪酸代謝や、薬物代謝酵素であるチトクロームP450(CYP)の還元に関与している。われわれは、b5Rの構造活性相関を解明するとともに、薬物相互作用にかかわるCYPのb5Rによる還元機構を解明するため、その詳細な立体構造を解析することを目標としている。そのためにまず既報告の手法でブタ肝臓由来のb5Rの膜外領域に存在する触媒ドメインの大腸菌による大量調製を行った。その結果、大腸菌培養液1Lあたり15mgのb5Rを取得した。この試料を用いて既に報告されている結晶化条件[14% PEG4000を含む0.1Mリン酸緩衝液(pH7.7)]で結晶化を行った。結晶を中性子構造解析に用いるためには、大型の結晶を作製する必要がある。そこでマクロシーディング法と蛋白質試料を逐次添加することによって、結晶の大型化に取り組み、これまでに最大長辺が約1mmの大型結晶の調製に成功した。この結晶を用いて現在予備的中性子回折実験を実施中である。

口頭

インターロイキン-13受容体$$alpha$$1鎖及びインターロイキン-4受容体$$alpha$$鎖細胞外ドメインの調製と性質

本庄 栄二郎; 正山 祥生; 玉田 太郎; 有馬 和彦*; 金地 佐千子*; 出原 賢治*; 黒木 良太

no journal, , 

アレルギーの発症に関与するサイトカインIL-13の受容体であるIL-13R$$alpha$$1及びIL-4$$alpha$$とリガンドであるIL-13との相互作用を解析するために、各受容体の細胞外ドメインの発現と調製を行った。IL-13R$$alpha$$1及びIL-4$$alpha$$の細胞外ドメインを、目的蛋白質の細胞外領域をアミノ酸配列の相同性と立体構造の予測モデルによって絞り込み、その領域を、トロンビン切断部位を有するポリアラニンリンカーを介し抗体Fc領域と融合した形態で発現させた。タンパク質の発現には片倉工業のトランスファーベクター/カイコ発現の系を利用した。発現されたFc融合蛋白質は、プロテインAカラムによって迅速に精製でき、IL-13R$$alpha$$1-Fcは、カイコ体液1mlあたり0.5mg、IL-4R$$alpha$$-Fcは、0.1mg調製した。最終的に、融合したFc領域をプロテアーゼ消化によって除去し、目的受容体の細胞外領域を調製した。調製した受容体のリガンド結合能を評価したところ、IL-4R$$alpha$$の存在下において、IL-13リガンドのIL-13R$$alpha$$1への親和性が増大することが確認できた。

口頭

Crystal structure of Delta1-tetrahydrocannabinolic acid synthase from ${it Cannabis sativa}$

正山 祥生; 玉田 太郎; 竹内 彩子*; 田浦 太志*; 正山 征洋*; 森元 聡*; 黒木 良太

no journal, , 

$$Delta$$1-Tetrahydrocannabinolic acid (THCA) synthase is the enzyme that catalyzes oxidative cyclization of cannabigerolic acid into THCA, the precursor of Delta1-tetrahydrocannabinol. In order to investigate the structure-function relationship of THCA synthase, this enzyme was overproduced in insect cells, purified and finally crystallized in 0.1 M HEPES buffer pH 7.5 containing 1.4 M sodium citrate. The crystal diffracted to 2.8 A resolution at beamline BL41XU, SPring-8. The crystal belonged to the primitive cubic space group P432, with unit-cell parameters a = b = c = 178.2 ${AA}$. R value of the structure model was 19.6%. Structure of THCA synthase was divided into two domains, and there was FAD of a coenzyme between domains. Based on the structural information obtained above, amino acid mutations of the four ionizable residues (H292, Y417, E442 and Y484) located in the vicinity of FAD is now in progress to clarify their contribution on its enzymatic function.

口頭

Neutron crystal structure analysis of HIV-1 protease complexed with KNI-272

安達 基泰; 大原 高志; 栗原 和男; 玉田 太郎; 本庄 栄二郎; 岡崎 伸生; 新井 栄揮; 正山 祥生; 松村 浩由*; 杉山 成*; et al.

no journal, , 

HIV-1プロテアーゼの阻害薬は、HIV-1プロテアーゼの構造をもとに作製され、抗エイズ薬の一つとして多剤併用療法の原動力となっている。しかし、薬剤耐性ウイルスの出現のために、より効果的な薬の開発が望まれている。本研究では、HIV-1プロテアーゼと阻害剤の相互作用及び触媒機構の理解をさらに深めるために、阻害剤KNI-272とHIV-1プロテアーゼとの中性子構造解析を実施した。その結果、KNI-272のApnsのカルボニルグループが、プロトン化されたAsp25と水素結合を形成すること、Apnsのヒドロキシルキがプロトン化されていないAsp25と水素結合を形成することが示された。それらの結果は、触媒反応においてAsp25が基質にプロトンを供与し、Asp125は加水分解に使われる水分子を活性化していることを示している。

口頭

Neutron crystallography for investigation of catalytic mechanism of HIV-1 protease

安達 基泰; 大原 高志; 栗原 和男; 玉田 太郎; 本庄 栄二郎; 岡崎 伸生; 新井 栄揮; 正山 祥生; 木村 要*; 松村 浩由*; et al.

no journal, , 

本研究では、プロテアーゼとその医薬品候補分子との分子間相互作用を原子レベルで解明することを目的として、阻害剤との複合体の中性子結晶構造解析を実施した。タンパク質の中性子結晶構造解析を行うには、高品質な大型結晶作成のために大量のタンパク質試料が必要となる。本研究では、コドン配列を最適化した人工遺伝子を合成することで効率的な大腸菌発現系を構築し、プロテアーゼの大量調製系を確立した。そして逆相クロマトグラフィーを用いることで自己分解物を完全に除去した純度の高い試料を調製して結晶化を行った。得られた結晶を用いてJRR-3設置しているBIX-4にて中性子回折データを収集した結果、1.9Aの回折データを得ることができた。プログラムPHENIXにより中性子とX線の同時精密化を実施し、世界で初めてHIV-1プロテアーゼの中性子結晶構造解析に成功した。重水素原子の存在と位置を確認するためにオミットマップを作成したところ、顕著な2つのピークを得た。プロトン化された触媒残基(Asp25)及び阻害剤のヒドロキシル基の構造を水素原子を含めて実験で初めて明らかにすることができた。

口頭

中性子構造解析を目的としたNADH-シトクロム${it b}$$$_{5}$$Rの結晶化

正山 祥生; 玉田 太郎; 黒木 良太; 木村 成伸*; 竹田 一旗*; 林 拓郎*; 三木 邦夫*

no journal, , 

NADH-シトクロム${it b}$ $$_{5}$$還元酵素(b5R)は、FADを持つピリジンヌクレオチド酵素でNADHからcytochrome${it b}$ $$_{5}$$への電子伝達を触媒する酵素である。このb5Rは脂肪酸代謝や薬物代謝酵素であるシトクロムの還元に関与することが明らかにされている。そこでわれわれはb5Rの構造活性相関を解明するとともに、薬物相互作用にかかわるCYPのb5Rによる還元機構を解明するため、中性子構造解析によって詳細な立体構造の解析を行うことを目標としている。そのためにまず既報告の手法でブタ肝臓由来のb5Rの膜外領域に存在する触媒ドメインの大腸菌による大量調製を行い、発現したb5Rを各種クロマトグラフィーによって高純度に単離精製した。その結果、大腸菌培養液1Lあたり15mgのb5Rを取得した。この試料を用いてb5Rの大型結晶作成に取り組み、マクロシーディングを行った結晶化溶液にタンパク質試料を逐次添加することで体積が約4mm$$^{3}$$の大型結晶の調製に成功した。また、この結晶を重水溶液に浸漬し予備的中性子回折実験を行ったところ、最大分解能が2${AA}$程度の回折点を得ることに成功した。

口頭

HIV-1プロテアーゼの中性子結晶構造解析

安達 基泰; 大原 高志; 栗原 和男; 玉田 太郎; 本庄 栄二郎; 岡崎 伸生; 新井 栄揮; 正山 祥生; 松村 浩由*; 杉山 成*; et al.

no journal, , 

本研究では、HIV-1プロテアーゼとその阻害剤分子との分子間相互作用を原子レベルで解明することを目的として、阻害剤KNI-272との複合体の中性子結晶構造解析を実施した。HIV-1プロテアーゼ遺伝子のコドン配列を大腸菌発現に最適化した人工遺伝子を合成し、大量発現系を確立した。精製には、陽イオン交換及び逆相クロマトグラフィーを用い、自己分解物を除去した純度の高い試料を調製した。結晶化は、2液バッチ法により行い、体積3.6mm$$^{3}$$の大型結晶を作製することに成功した。得られた結晶からJAEAのJRR-3に設置している回折計BIX-4にて1.9${AA}$分解能の中性子回折データを収集した。さらに1.4${AA}$分解能のX線回折データも収集し、プログラムPHENIXにより中性子とX線の両方の回折データを用いて立体構造を精密化した。中性子のデータに対しR値19.3% (freeR値22.2%)、X線のデータに対しR値17.3%(freeR値20.3%)まで構造を精密化した。その結果、2つの触媒残基(Asp25及びAsp125)のプロトン化状態と水素原子を含めた立体構造を実験的に明らかにすることができた。

口頭

Structure of HIV-1 protease in complex with potent inhibitor KNI-272 determined by neutron crystallography

安達 基泰; 大原 高志; 栗原 和男; 玉田 太郎; 本庄 栄二郎*; 岡崎 伸生; 新井 栄揮; 正山 祥生*; 松村 浩由*; 安達 宏昭*; et al.

no journal, , 

HIV-1プロテアーゼの触媒機構を解明するために、HIV-1プロテアーゼとペプチドに類似した阻害剤KNI-272との複合体の中性子結晶構造解析を行った。その結果、阻害剤KNI-272の一部であるアロフェニルノルスタチンのカルボキシル基がプロトン化したAsp25残基と水素結合を形成し、一方で、アロフェニルノルスタチンの水酸基が脱プロトン化したAsp125残基と水素結合を形成していることが明らかとなった。以上の結果は、Asp25残基がHIV-1プロテアーゼの基質のカルボキシル基にプロトンを供与し、Asp125が求核攻撃を行う水分子を活性化する役割を持つことを示している。

口頭

放射光と中性子を相補的に用いたヒト免疫不全ウイルスプロテアーゼ-阻害剤の立体構造解析

安達 基泰; 大原 高志; 栗原 和男; 玉田 太郎; 本庄 栄二郎*; 岡崎 伸生; 新井 栄揮; 正山 祥生*; 松村 浩由*; 杉山 成*; et al.

no journal, , 

本研究では、HIV-1プロテアーゼとその医薬品候補分子との分子間相互作用を原子レベルで解明することを目的として、阻害剤KNI-272との複合体の結晶構造解析をX線及び中性子の両方の量子ビームを用いて実施した。最終的に中性子のデータに対しR値19.3%(freeR値22.2%)、X線のデータに対しR値17.3%(freeR値20.3%)まで構造を精密化し、HIV-1プロテアーゼの中性子結晶構造解析に成功した。さらに、SPring-8のBL41XUにおいて、クライオ条件(100K)で分解能0.93${AA}$の回折データを取得し、プログラムSHELX-97により構造をR値10.4%(freeR値12.4%)にまで精密化した。そして、触媒残基のカルボキシル基の炭素原子と酸素原子の間の結合長を求めた結果、触媒残基の2つのアスパラギン酸(Asp25とAsp125)のうちAsp25のみがプロトン化されていることが示唆され、中性子構造解析の結果と一致した。これらの知見は、HIV-1プロテアーゼの触媒機構の解明及びより親和性の高い医薬品候補分子の創製において重要である。

口頭

Structure of HIV-1 protease in complex with potent inhibitor KNI-272 determined by neutron crystallography

安達 基泰; 大原 高志; 栗原 和男; 玉田 太郎; 本庄 栄二郎*; 岡崎 伸生; 新井 栄揮; 正山 祥生*; 松村 浩由*; 安達 宏昭*; et al.

no journal, , 

HIV-1プロテアーゼはヒト免疫不全ウイルス(エイズウイルス)が産生する酸性プロテアーゼであり、Asp25とAsp125を触媒残基としている。HIV-1プロテアーゼはエイズウイルスの増殖に必須であることから、エイズ治療のための創薬標的タンパク質となっている。本研究では、HIV-1プロテアーゼとその医薬品候補分子との分子間相互作用を原子レベルで解明することを目的として、阻害剤KNI-272との複合体の結晶構造解析をX線及び中性子の両方の量子ビームを用いて実施した。

口頭

NADH-シトクロム${it b$_{5}$}$還元酵素の中性子構造解析

平野 優; 山田 貢*; 栗原 和男; 正山 祥生*; 黒木 良太; 日下 勝弘*; 木村 成伸*; 竹田 一旗*; 三木 邦夫*; 玉田 太郎

no journal, , 

NADH-シトクロム${it b$_{5}$}$還元酵素(b5R)はフラボタンパク質の1つで、その酸化還元反応に伴いチトクロム${it b$_{5}$}$等の電子受容体に電子を伝達するが、この反応は小胞体における薬物代謝や脂質合成に深く関与することが知られている。これまでに実施した酸化型および還元型b5RのX線結晶解析の結果から、b5Rの酸化還元サイクルの理解が深まったが、電子授受にかかわる補因子(FAD)や周辺のアミノ酸側鎖の水素原子を含む詳細な構造を決定するには至っていない。そこで、水素原子を含めた詳細な構造情報に基づくb5Rの酸化還元サイクル解明を目指して、b5Rの中性子構造解析を実施した。約2mm$$^{3}$$の大型結晶を段階的に抗凍結溶液に浸漬することにより低温下での中性子回折実験を実現し、J-PARC/MLFのBL03(iBIX)において1.4${AA}$分解能の回折データの収集に成功した。引き続き、中性子とX線の両回折データを相補的に用いた構造精密化を行うため、同一結晶を用いてPF BL5AにおいてX線回折実験を行い、0.85${AA}$分解能の回折データを取得した。本発表では、得られた構造の詳細について紹介する。

21 件中 1件目~20件目を表示