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白石 伊世; 鈴木 雅雄*; 鹿園 直哉; 藤井 健太郎; 横谷 明徳
Journal of Radiation Research, 55(Suppl.1), p.i92 - i93, 2014/03
In a living cell, cluster DNA damage is thought to be processed by several different pathways simultaneously or sequentially. Under this situation the cellular response to cluster DNA might depend on the order of repair processes because the configuration of the lesions will be modified by the reaction of initial repair protein, affecting the DNA-binding or excision activities of latter proteins. In the present study, we investigate whether initial enzymatic repair affects latter processes. Plasmid DNA exposed to C ion is treated with two base excision repair enzymes, Nth and Fpg, which convert pyrimidine and purine lesions to a SSB, respectively. Obtained results show that the amount of enzymatically induced SSB is very slightly less in DNA sample treated with Nth first and then Fpg than that of other treatments. These results indicate that the configuration-change of the cluster by the first enzymatic treatment does not significantly influence the activity of secondary enzyme.
椎名 卓也; 渡辺 立子; 白石 伊世; 鈴木 雅雄*; 菅谷 雄基; 藤井 健太郎; 横谷 明徳
Radiation and Environmental Biophysics, 52(1), p.99 - 112, 2013/03
被引用回数：18 パーセンタイル：59.22(Biology)Plasmid DNA was irradiated with carbon ions or X-rays in solutions containing several concentrations of Tris (0.66-200 mM) to determine the yield of abasic (AP) sites and the effect of scavenging capacity. The yield of AP sites, detected as single strand breaks (SSB) after digestion with E. coli endonucrease IV (Nfo), was compared with that of SSB and base lesions. At higher concentrations of Tris, the yields of single or clustered AP sites were significantly lower than those of single or clustered base lesions. The dependence of the yield of AP sites on scavenging capacity was similar to that of prompt strand breaks. These results indicate that the reaction of water radiolysis products, presumably OH radicals, with the sugar-phosphate moieties in the DNA backbone induces both AP sites and SSB with similar efficiency.
椎名 卓也; 菅谷 雄基; 白石 伊世; 渡辺 立子; 横谷 明徳
no journal, ,
本研究では電離放射線によって生じるDNA損傷のうちAP siteに着目し、難修復性のクラスターDNA損傷を構成する要素としてのAP siteの収率の放射線の線質依存性を明らかにすることを目的とした。AP siteが他の損傷とクラスターを構成することでその後の修復過程に大きく影響することが、多くの合成クラスター損傷を含むオリゴヌクレオチドを用いた実験により明らかにされつつある。われわれは、スキャベンジャー濃度をさまざまに変えたプラスミドDNAを試料として用い、これに異なる線質の放射線を照射した際に生じるAP siteとこれを含むクラスターDNA損傷の収率の違いを調べた。AP siteは、AP lyaseのひとつである大腸菌由来のEndoculeaseIV (Nfo)で処理することで、鎖切断として検出した。試料中のスキャベンジャー濃度を変えることで、AP site生成に果たす直接効果と間接効果の違いについても調べた。本講演では、X線及びHIMACから得られる高LETのCイオンビームの照射により、AP site及びこれを含むクラスターDNA損傷の生成過程の違いを議論する。
菅谷 雄基; 白石 伊世; 椎名 卓也; 藤井 健太郎; 横谷 明徳
no journal, ,
DNA分子中の酸素の1sイオン化閾値以下の共鳴準位エネルギー(532.8eV)とその前後(530.0及び534.9eV)を照射し、鎖切断,塩基変異及びAPサイトの定量を行った。試料には、プラスミドDNA(pUC18)を用い、乾燥させたDNAフィルムに対して真空中で軟X線照射を行った。ピリミジン塩基損傷,プリン塩基損傷及びAPサイトの検出は、それぞれNth, Fpg, Nfoの3種類のDNAグリコシレースで処理することでSSB(single strand break)に変換した後、アガロースゲル電気泳動によるコンフォメーション変化の観察を行った。閉環状構造のプラスミドDNAは、SSB, DSBの生成によりそれぞれ開環状構造、直鎖状構造へとコンフォメーションが変化するため、泳動後のゲル上のバンド濃度として簡便に定量することが可能である。得られた結果は、いずれのエネルギーにおいてもSSB収率がイオン化閾値以上(560eV)の既報値とほぼ一致したのに対し、Nth, Fpg, Nfoで検出される塩基損傷、APサイトの収率はイオン化閾値以上で得られている値と比較して極めて低かった。塩基変異の生成に、DNAあるいは配位水の酸素の完全なイオン化が必要であることが示唆された。
横谷 明徳; 白石 伊世; 鹿園 直哉
no journal, ,
本研究では、クラスターDNA損傷に対する塩基除去修復酵素の作用機序の違いがクラスターDNA損傷の難修復特性にどのようにかかわるかを明らかにすることを目的とした。高LETのイオンビームを照射したプラスミドDNA(pUC18)をNthとFpgの2種類のグリコシレースで処理し、酵素活性を生じたニック(SSB)量としてpUC18の立体構造変化としてゲル電気泳動法により定量した。この際、2種類の酵素の処理の順番をさまざまに変えたときに、ニッキング活性にどのような差が見られるのかについて調べた。C
イオンビームを照射した場合はFpgを先に処理したものの方が、同時処理やNthを先に処理したものより損傷を持たない閉環型分子の線量あたりの残存量が約5%小さい傾向にあった。講演では収量の差をもたらす原因としてのクラスター損傷の構造について議論する。
椎名 卓也; 菅谷 雄基; 白石 伊世; 渡辺 立子; 横谷 明徳; 鶴岡 千鶴*; 鈴木 雅雄*
no journal, ,
APサイトが他の損傷とクラスターを構成することでその後の修復過程に大きく影響することが多くの合成クラスター損傷を含むオリゴヌクレオチドを用いた実験により明らかにされつつある。われわれは、スキャベンジャー濃度をさまざまに変えたプラスミドDNAを試料として用い、これに異なる線質及び異なるLETの放射線を照射した際に生じるAPサイトとこれを含むクラスターDNA損傷の収率の違いを調べている。APサイトは、AP lyaseの一つである大腸菌由来のEndoculeaseIV (Nfo)で処理することで、鎖切断として検出した。試料中のスキャベンジャー濃度を変えることで、APサイト生成に果たす直接効果と間接効果の違いについても調べた。その結果、線質及びLETの違いによってNfo認識サイトの収率に差が見られた。本研究では、X線及びHIMACから得られる炭素イオンビーム(290MeV/nucleon, LET 13, 60keV/
m)の照射により生じるAPサイト及びこれを含むクラスターDNA損傷の収率を定量し、鎖切断や塩基損傷の収率に関する従来のデータと比較することで、APサイトの生成プロセスが他の損傷、特に塩基損傷の場合と異なる可能性を見いだした。
白石 伊世; 椎名 卓也; 菅谷 雄基; 鹿園 直哉; 横谷 明徳
no journal, ,
クラスターDNA損傷は、SSBや塩基損傷,APサイトなどから構成されるため、これらに対する細胞応答において異なる修復系が同時にあるいは逐次的に関与することが予測される。最初に作用する修復タンパク質によりクラスター損傷の性質が変化するため、作用する修復系の順序がその後の生物応答に大きな違いをもたらす可能性がある。本研究では、クラスターDNA損傷に対する塩基除去修復酵素の作用機序の違いがクラスターDNA損傷の難修復特性にどのようにかかわるかを明らかにすることを目的とした。高LETのイオンビームを照射したプラスミドDNA(pUC18)をNthとFpgの2種類のグリコシレースで処理し、酵素活性を生じたニック(SSB)量としてpUC18の立体構造変化としてゲル電気泳動法により定量した。この際、2種類の酵素の処理の順番をさまざまに変えた時に、ニッキング活性にどのような差が見られるのかについて調べた。C6+イオンビームを照射した場合はFpgを先に処理したものの方が、同時処理やNthを先に処理したものより損傷を持たない閉環型分子の線量あたりの残存量が約5%小さい傾向にあった。講演では収量の差をもたらす原因としてのクラスター損傷の構造について議論する。
菅谷 雄基; 椎名 卓也; 白石 伊世; 藤井 健太郎; 横谷 明徳
no journal, ,
本研究では、軟X線を照射したDNAに生成される鎖切断や塩基損傷,APサイトを定量し、内殻励起やイオン化が選択的損傷生成に果たす役割を明らかにすることを目的とする。試料にはプラスミドDNA(pUC18)を用い、SPring-8のBL23SUを使用して照射を行った。ピリミジン塩基損傷及びプリン塩基損傷,APサイトの検出は、それぞれNth, Fpg, Nfoの3種類のDNAグリコシレースで処理しSSB(single strand break)に変え、アガロース電気泳動法によって定量した。その結果、酸素のK殻電子の6
励起では各損傷の収率は他のエネルギーにおける照射と比較して、小さいことが明らかになった。この理由として、試料に含まれる塩類の酸素の内殻吸収は損傷生成に寄与していない可能性が示唆された。
椎名 卓也; 菅谷 雄基; 白石 伊世; 渡辺 立子; 鈴木 雅雄*; 横谷 明徳
no journal, ,
今まで明らかにされていなかったAPサイト及びAPクラスターの誘発過程と炭素イオン(290MeV/n, LET13, 60keV/um)、あるいはX線のトラック構造との関係を明らかにするため、放射線照射したpUC18プラスミドDNAの酵素処理により放射線誘発性APサイトの収率を定量した。幾つかのスキャベンジャー能のサンプルでAPサイトの誘発について拡散性OHラジカルの間接効果を評価した。その結果、これまでの研究で明らかにされていた鎖切断や塩基損傷と同様のスキャベンジャー能依存性を示した。さらに、調べた放射線のすべてでAPサイトと鎖切断のスキャベンジャー能依存性の挙動が一致したことから、鎖切断とAPサイトが同様の生成過程を経ており、塩基損傷の生成過程とは異なることが示唆された。この結果をモンテカルロシミュレーションから得られた損傷収率と比較,検討する予定である。
菅谷 雄基; 椎名 卓也; 白石 伊世; 藤井 健太郎; 横谷 明徳
no journal, ,
酸素のK殻イオン化を引き起こすと、塩基損傷収率が窒素のK殼イオン化の収率と比べ急激に増えることがわかっている。本研究では、軟X線を照射したDNAに生成される鎖切断や塩基損傷,APサイトを定量し、内殻励起やイオン化が選択的損傷生成に果たす役割を明らかにすることを目的とする。試料にはプラスミドDNAを用い、SPring-8のBL23SUを使用して照射を行った。ピリミジン塩基損傷及びプリン塩基損傷,APサイトの検出は、それぞれNth, Fpg, Nfoの3種類のDNAグリコシレースで処理しSSB(single strand break)に変え、アガロース電気泳動法によって定量した。その結果、予想に反しDNA中の酸素を1sから
へ選択的に励起を引き起こす軟X線を照射すると、DNA損傷収率が大きく減少することがわかった。これは、励起により生じた1価の陽イオンは、イオン化による2価の陽イオンに比べ、損傷誘発に大きくは寄与しない可能性を示している。本国際会議では、酸素のK殼イオン化エネルギー領域についてのDNA損傷の収率変化を報告し、それらがDNA損傷の選択的な生成機構に寄与するかについて議論する。
白石 伊世; 椎名 卓也; 菅谷 雄基; 鹿園 直哉; 横谷 明徳
no journal, ,
In a living cell, a multiply damaged site in DNA is thought to be processed by several different pathways simultaneously or sequentially. Under this situation the cellular response to the lesion cluster might depend on the order of repair processes because the configuration of the lesions will be modified by the reaction of initial repair protein, affecting the DNA-binding or lesion-excision activities of latter repair proteins. Plasmid DNA (pUC18) irradiated with C ion is treated with two base excision repair enzymes, Nth and Fpg, which convert pyrimidine and purine lesions to a SSB, respectively. Obtained results show that the amount of enzymatically induced SSB is very slightly less in DNA sample treated with Nth first and then Fpg than that of other treatments. These results indicate that the configurational change of the cluster by the first enzymatic treatment does not significantly influence the activity of secondary enzyme.
白石 伊世; 椎名 卓也; 菅谷 雄基; 鹿園 直哉; 横谷 明徳
no journal, ,
DNAの1
2ヘリカルターンに複数の損傷が局在化したクラスターDNA損傷は、突然変異などの生物影響を引き起こす主要な原因の一つであるとされている。クラスター損傷はさまざまな損傷から構成されているため、これらに対する細胞応答において異なる修復系が同時にあるいは逐次的に関与することが予測される。本研究では、クラスターDNA損傷に対する塩基除去修復酵素の作用機序の違いがクラスターDNA損傷の難修復特性にどのようにかかわるかを明らかにすることを目的とした。イオンビームを照射したプラスミドDNAで、2種類のグリコシレースの処理の順番をさまざまに変えインキュベートし、酵素活性で生じたニック(SSB)量を立体構造変化としてゲル電気泳動法により定量した。Cイオンビームを照射した場合はFpgを先に処理したものの方が、同時処理やNthを先に処理したものより損傷を持たないDNAの残存量が小さい傾向にあった。さらに、DNAの熱変性を利用する新しい分析法を用いることで、従来検出できなかったプラスミド上の複数の損傷を検出することができると期待される。講演では、上述した逐次処理にみられた収率の差をもたらす原因としてのクラスター損傷の構造について発表する。
椎名 卓也; 白石 伊世; 菅谷 雄基; 渡辺 立子; 鈴木 雅雄*; 横谷 明徳
no journal, ,
本研究では、APサイト及びこれを含むクラスターDNA損傷の生成過程の、放射線のトラック構造及びLETに対する依存性を明らかにすることを目的とする。試料としてプラスミドDNA水溶液を用い、これに対してCイオン及びX線を照射し、生成したAPサイトを定量した。また試料溶液中のスキャベンジャー能を変えることで、APサイト誘発における拡散性OHラジカルの寄与を調べた。その結果、スキャベンジャー能が高くなるとAPサイトの収率は低下し、またその減少のスキャベンジャー能依存性がDNA鎖切断のそれとよく似ていることが明らかになった。これらの結果から、鎖切断とAPサイトの生成が同じ反応中間体であるOH-adductに開始され途中まで同じ経路をたどり、塩基損傷の生成経路とは異なることが示唆された。現在これらの実験データをモンテカルロ法によりシミュレーションしており、発表ではAPサイトを含めたDNA損傷生成の一般モデルについて提案をする予定である。
菅谷 雄基; 椎名 卓也; 白石 伊世; 藤井 健太郎; 横谷 明徳
no journal, ,
放射光を光源として用い、軟X線のエネルギーの違いがどのようなDNA損傷の違いをもたらすかについて、その生成過程を含めて研究している。過去の研究から、酸素のK殻イオン化を引き起こすと、塩基損傷収率が窒素のK殼イオン化の収率と比べ急激に増え、酸素の1sからへの励起を選択的に引き起こしたときはDNA損傷の収率が1sから
の励起やイオン化と比べ減少することが報告されている。今回は、これまでの試料とは異なり、緩衝液の塩を含まないプラスミドDNA(pUC18)のみを薄膜の状態にし、SPring-8のBL23SUから得られる単色軟X線を照射した。この試料を用いることで、塩に含まれる酸素のK殻イオン化による影響を排除することが可能となる。今回、DNA薄膜の作製方法を改良し、より薄い厚さの均一なリング状の膜を得ることに成功した。また、AFMを用いた膜厚測定とその結果を用いた吸収線量の評価を行ったので、これらの結果を報告する予定である。
菅谷 雄基; 成田 あゆみ; 椎名 卓也; 白石 伊世; 藤井 健太郎; 横谷 明徳
no journal, ,
緩衝液の塩を含まないプラスミドDNA(pUC18)のみの薄膜を作成し、この薄膜に対して酸素XANES領域の軟X線を照射したときに生成されるDNA鎖切断や塩基損傷、APサイトを定量した。軟X線照射は、SPring-8のBL23SUから得られる高分解能の単色軟X線を利用した。作成したDNA薄膜をAFMにより観察すると、リング状に広がった膜であった。AFM像から推定した厚みは200nmであり、酸素K殻XANES領域のX線は充分透過することがわかった。ピリミジン塩基損傷及びプリン塩基損傷、APサイトの検出は、それぞれNth, Fpg, Nfoの3種類のDNAグリコシレースで処理しSSB(single strand break)に変え、アガロース電気泳動法によって定量した。得られた結果は、酸素の1sイオン化閾値を超えた場合と比較し、1sから反結合軌道への励起によりDNA損傷収率は大きく減ることが明らかになった。またイオン化閾値以上では、特にピリミジン塩基損傷の収率が増大することも明らかになった。酸素XANES領域近傍のエネルギーで、さまざまな損傷の収率の絶対値や損傷間の相対値が、軟X線のエネルギーに大きく依存することが結論される。
