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論文

Analysis of DNA strand breaks induced by carbon ion beams in ${{it Arabidopsis}}$

寺西 美佳*; 山口 弘子*; 坂本 綾子; 日出間 純*

JAEA-Review 2014-050, JAEA Takasaki Annual Report 2013, P. 115, 2015/03

Ion beams induce DNA damage, such as strand breaks, possibly resulting in an increased mutation frequency. To elucidate the mechanism of mutation induction in plants, it is important to know about which DNA damage converted into a mutation. In this study, we examined the method for determining the number of DNA strand breaks induced by carbon ion beams in Arabidopsis seedlings. Seeds of Arabidopsis thaliana (wild-type Colombia) were aseptically sown on Murashige and Skoog agar plates. The seedlings were irradiated with carbon ion beams from an AVF cyclotron. After irradiation, whole plants were harvested immediately in order to detect the induced DNA strand breaks. The number of DNA strand breaks increased with increasing dose of carbon ion beams. Irradiation of seedlings with 960 Gy of carbon ion beams resulted in up to 2.3 strand breaks per megabase (Mb). In this study, only DNA double strand breaks can be detected using the non-denatured agarose gel electrophoresis. To elucidate the mechanism of mutation induction in plants, measurement of the extent of DNA damage other than DNA strand breaks should be needed. Further analysis is in progress.

論文

Isolation of a novel UVB-tolerant rice mutant obtained by exposure to carbon-ion beams

高野 成央*; 高橋 祐子*; 山本 充*; 寺西 美佳*; 山口 弘子*; 坂本 綾子; 長谷 純宏; 藤澤 弘子*; Wu, J.*; 松本 隆*; et al.

Journal of Radiation Research, 54(4), p.637 - 648, 2013/07

 被引用回数:11 パーセンタイル:51.49(Biology)

UVB radiation suppresses photosynthesis and protein biosynthesis in plants, which in turn decreases growth and productivity. Here, an ultraviolet-B (UVB)-tolerant rice mutant, ${it utr319}$ (${it UV Tolerant Rice 319}$), was isolated from a mutagenized population derived from 2,500 M1 seeds that were exposed to carbon ions. The ${it utr319}$ mutant was more tolerant to UVB than the wild type. Neither the levels of UVB-induced CPDs, nor the repair of cyclobutane pyrimidine dimers or (6-4) pyrimidine-pyrimidone photodimers was altered in the ${it utr319}$ mutant. Thus, the ${it utr319}$ mutant may be impaired in the production of a previously unidentified factor that confers UVB tolerance. To identify the mutated region in the ${it utr319}$ mutant, microarray-based comparative genomic hybridization analysis was performed. Two adjacent genes on chromosome 7were predicted to represent the mutant allele. Sequence analysis of the chromosome region in ${it utr319}$ revealed a deletion of 45,419 bp. Database analysis indicated that the Os07g0265100 gene, ${it UTR319}$, encodes a putative protein with unknown characteristics or function. In addition, the homologs of UTR319 are conserved only among land plants. Therefore, ${it utr319}$ is a novel UVB-tolerant rice mutant and UTR319 may be crucial for the determination of UVB sensitivity in rice, although the function of UTR319 has not yet been determined.

論文

Mutational effects of $$gamma$$-rays and carbon ion beams in ${it Arabidopsis}$ seedlings

吉原 亮平*; 野澤 樹; 長谷 純宏; 鳴海 一成; 日出間 純*; 坂本 綾子

Journal of Radiation Research, 54(6), p.1050 - 1056, 2013/05

 被引用回数:16 パーセンタイル:62.12(Biology)

To assess the mutational effects of radiations in vigorously proliferating plant tissue, mutation spectrum was analyzed with ${it Arabidopsis}$ seedlings via plasmid rescue method. Transgenic plants containing ${it Escherichia coli rpsL}$ gene were irradiated with $$gamma$$-rays and carbon ion beams (320 MeV $$^{12}$$C$$^{6+}$$), and mutations in the ${it rpsL}$ gene were analyzed. Mutant frequency was significantly increased by $$gamma$$-rays, but not by 320 MeV $$^{12}$$C$$^{6+}$$. Mutation spectrum showed that both radiations increased the frequency of frameshifts and other mutations including deletion/insertion but that only $$gamma$$-rays increased the frequency of total base substitutions. These results suggest that the type of DNA lesions which cause base substitutions were less induced by 320 MeV $$^{12}$$C$$^{6+}$$ than by $$gamma$$-rays in ${it Arabidopsis}$ seedlings. $$gamma$$-rays never increased the frequencies of G:C to T:A and A:T to C:G transversions, which are caused by oxidized guanine, though 320 MeV $$^{12}$$C$$^{6+}$$ slightly increase the both transversions. Instead, $$gamma$$-rays significantly increased the frequency of G:C to A:T transition. These results suggest that 8-oxoguanine has little effect on mutagenesis in ${it Arabidopsis}$ cells.

論文

Analysis of mutated region on DNA in ion beam-induced UVB tolerant or sensitive rice mutant

高野 成央*; 高橋 祐子*; 山本 充*; 寺西 美佳*; 長谷 純宏; 坂本 綾子; 田中 淳; 日出間 純*

JAEA-Review 2011-043, JAEA Takasaki Annual Report 2010, P. 104, 2012/01

UVB radiation can affect the plant growth and development. The aim of this study is identify new factor(s) related to UVB tolerance in plants by bioengineering or breeding programs. To produce UVB tolerant or sensitive mutants, dry seeds of Japanese rice cultivar Sasanishiki were exposed with carbon ion beams, and two UVB tolerant and three UVB sensitive mutants were isolated from the offspring of irradiated plants. By analysis of comparative genomic hybridization and sequencing of bacterial artificial chromosome library, we identified the mutated regions in a UVB tolerant mutant ${it utr319}$ and a UVB sensitive mutant ${it usr1}$.

論文

Effect of different LET radiations on root growth of ${it Arabidopsis thaliana}$

吉原 亮平; 野澤 樹; 雑賀 啓明*; 寺西 美佳*; 土岐 精一*; 日出間 純*; 坂本 綾子

JAEA-Review 2010-065, JAEA Takasaki Annual Report 2009, P. 74, 2011/01

This study aimed to elucidate the effects of ion beams on ${it Arabidopsis thaliana}$. We focus on (1) what kinds of damage are produced by ion beams, and (2) what kinds of cellular processes are involved in turn the damage into mutations. Our results suggest that 220 MeV carbon ions may induce more numbers of DNA lesions or more severe types of DNA lesions than $$gamma$$-rays and 50 MeV helium ions. Our results also suggest that the considerable amount of DNA lesions induced by $$gamma$$-rays and 50 MeV helium ions are repaired by non-homologous end-joining (NHEJ) repair mechanism, but the majority of DNA lesions induced by 220 MeV carbon ions are not repaired by NHEJ.

口頭

イオンビーム誘発UVB耐性変異体イネの解析

高野 成央*; 高橋 祐子*; 山本 充*; 寺西 美佳*; 横沢 大輔*; 長谷 純宏; 坂本 綾子; 田中 淳; 日出間 純*

no journal, , 

イネのUVB耐性獲得にかかわる主因子の1つは、UVBによって誘発されるシクロブタン型ピリミジン二量体(CPD)を修復するCPD光回復酵素であることを明らかにした。しかし、その他のUVB耐性因子は明らかになっていない。そこで新たなUVB耐性遺伝子資源の探索を目的に、UVB耐性を示すイネ・ササニシキにカーボンイオンビームを照射し、ササニシキよりもUVB耐性、又は感受性を示す変異体の選抜を行った。その結果、UVB感受性を示す変異体2系統,耐性を示す変異体3系統の選抜に成功した。われわれは、得られた系統の中でもUVB耐性を示すイネ変異体UVTSa-319に着目し、変異原因遺伝子の同定を目的に特徴解析を行った。親株のササニシキと比較してUVTSa-319は既知のUVB耐性因子であるUV吸収物質の蓄積量、CPD及び6-4光産物の光修復・暗修復活性に変異は認められなかった。また、ゲノムDNAを用いたアレイComparative Genomic Hybridization(CGH)により変異・欠損領域の推定を行ったところ、第7染色体上に約40kbpの欠失があり、その領域に機能未知の2つの遺伝子が含まれていた。本大会では、新規なUVB耐性遺伝子の可能性に関して考察する。

口頭

イオンビーム誘発UVB耐性・感受性変異体のゲノム変異箇所と遺伝子発現解析

高野 成央*; 高橋 祐子*; 山本 充*; 寺西 美佳*; 長谷 純宏; 坂本 綾子; 田中 淳; 日出間 純*

no journal, , 

イネのUVB耐性獲得にかかわる主因子の1つは、UVBによって誘発されるシクロブタン型ピリミジン二量体(CPD)を修復するCPD光回復酵素であるが、いまだUVB耐性機構の全容は明らかになっていない。そこで、UVB耐性遺伝子資源の探索を目的に、UVB抵抗性イネ・ササニシキに炭素イオンビームを照射して、UVB耐性,感受性を示す変異体の選抜を行った。その結果、親株のササニシキよりも耐性を示す変異体UVTSa-319及び感受性を示す変異体UVSSa-1の選抜に成功した。これらの変異体は、親株のササニシキと比較して既知のUVB耐性因子に変異は認めらなかった。変異部位を同定するため、UVTSa-319、及びUVSSa-1のゲノムDNAを用いたアレイCGH法により、各変異体の欠損領域の推定を行った。UVTSa-319では第7染色体の二つの機能未知遺伝子、UVSSa-1では第七染色体の二つの遺伝子の欠失が推定され、ゲノムPCRによってもこの領域が欠失していることを確認した。本大会では、各変異体と親株間で行った発現アレイ解析の結果を含め、変異原因遺伝子とUVB耐性との関係について考察する。

口頭

イオンビーム誘発UVB耐性変異体イネUVTSa-319の生理学的特徴解析

高野 成央*; 高橋 祐子*; 山本 充*; 寺西 美佳*; 長谷 純宏; 坂本 綾子; 田中 淳; 日出間 純*

no journal, , 

イネのUVB耐性獲得にかかわる主因子は、UVBによって誘発されるシクロブタン型ピリミジン2量体(CPD)を修復するCPD光回復酵素である。しかし、未だUVB耐性機構の全容は明らかになっていない。これまでにわれわれはUVB耐性にかかわる因子の探索を目的に、UVB抵抗性イネ・ササニシキを親株として、炭素イオンビーム誘発UVB耐性変異体UVTSa-319の選抜に成功し、解析を進めてきた。これまでの解析により、UVTSa-319は野生型と比較し、CPDの生成数(UVBの透過性)や修復活性には差がないこと、また、第7染色体の機能未知遺伝子2つを含む約45kbが欠損していることがわかっている。UVBはCPDや6-4光産物、酸化損傷などのDNA損傷を誘発し、DNAの複製を阻害する。そこでわれわれはUVTSa-319の変異がUVBによる複製阻害に影響を及ぼしているのかを調べるため、複製阻害剤であるヒドロキシウレアやDNA架橋形成等を誘発するマイトマイシンCが含まれた寒天培地上での種子根の生育を野生型とUVTSa-319とで比較した。その結果、UVTSa-319はこれらの試薬に対して、野生型と比較して耐性を示すことがわかった。本大会ではこれらの結果を踏まえ、UVTSa-319が獲得したUVB耐性機構について考察する。

口頭

量子ビーム変異誘発機構の解明; 高効率な育種素材創成を目指して

日出間 純*; 寺西 美佳*; 土岐 精一*; 雑賀 啓明*; 坂本 綾子; 吉原 亮平

no journal, , 

イオンビームを用いた植物の突然変異誘発の研究は、原子力機構が研究拠点となり、高崎量子応用研究所のイオン照射装置(TIARA)を利用して、世界に先駆けて行われてきた。イオンビームによる突然変異体育種の特徴として、(1)低LET放射線と比較して、突然変異誘発率が高く、変異スペクトラムが広いこと、(2)1つの形質のみに変異が生じ、変異形質が安定している、等が知られている。しかし、従来の方法と同様に、イオンビーム育種においても突然変異の方向性はランダムかつ偶発的であり、また多大な労力が必要とされるため、より有効な技術が望まれていた。本研究では、モデル植物を利用して、さまざまなDNA修復系とそれが関与する突然変異スペクトラムとの関係を明らかにすることにより、これまでランダムで偶発的と考えられてきた突然変異の誘発に関して、その誘発機構を制御することにより、より効率的な育種素材を創成することを目指している。

口頭

放射線誘発DNA酸化損傷がシロイヌナズナの突然変異に与える影響

吉原 亮平; 長谷 純宏; 野澤 樹; 鳴海 一成; 滝本 晃一*; 日出間 純*; 坂本 綾子

no journal, , 

放射線は、細胞内でDNA酸化損傷を生成し、突然変異を誘発することが知られている。われわれは、シロイヌナズナ幼植物体を用いて変異スペクトル解析を行うことで、DNAの酸化損傷の変異誘発に対する影響を評価することにした。さらに、ヌクレオチドプール浄化機構に関与する${it mutT}$遺伝子のホモログ(${it NUDT1}$遺伝子)を欠損したシロイヌナズナにおける突然変異解析を行い、植物におけるヌクレオチドプール浄化機構の放射線誘発変異抑制における影響を評価した。${it NUDT1}$遺伝子欠損体の$$gamma$$線感受性は、野生型に比べてやや高かったが、統計学的有意差を示すことができるほどの差はなかった。しかし、${it NUDT1}$遺伝子欠損体における$$gamma$$線誘発突然変異スペクトルは、野生型と異なるスペクトルを示した。よって、${it NUDT1}$遺伝子の欠損は、植物の放射線感受性には影響を与えないものの、突然変異誘発に影響を与えていることが示唆された。

口頭

イオンビーム誘発UVB感受性変異体イネ${it usr1}$の特徴解析

千葉 和宏*; 高野 成央*; 山本 充*; 寺西 美佳*; 長谷 純宏; 坂本 綾子; 田中 淳; 日出間 純*

no journal, , 

イネのUVB耐性にかかわる主要因子の一つは、UVB誘発シクロブタン型ピリミジン二量体(CPD)を修復するCPD光回復酵素であるが、他のUVB耐性にかかわる因子は未だ不明である。われわれは、UVB耐性にかかわる遺伝子資源の探索を目的に、UVB耐性を示すイネ・ササニシキを親株とし、変異原として炭素イオンビーム(320MeV: $$^{12}$$C$$^{6+}$$, 80Gy)を用いて、UVB感受性変異体イネ${it Uv sensitive rice-1}$(${it usr1}$)の選抜に成功し、解析を進めてきた。その結果、usr1は第7染色体上の2つの遺伝子を含む、約52kbpの領域が欠失していることがわかった。次にusr1の生理学的特性について親株と比較したところ、既知のUVB耐性因子であるUV吸収物質の蓄積量、CPD及び6-4光産物の生成頻度に差は見られなかった。また、UVB照射後の根の生育を感受性の指標とした、光条件及び暗条件でのRoot bending assayを行った結果、${it usr1}$は光条件、暗条件の両方で野生型よりもUVB感受性を示した。さらに、${it usr1}$のUVB誘発CPD及び6-4光産物の光修復活性、暗修復活性をELISA法により解析したところ、野生型と比べて有意な差は見られなかった。これらの結果より、${it usr1}$の示すUVB感受性は、既知のUVB耐性にかかわる因子ではなく新規の因子が関与している可能性が示された。

口頭

イオンビーム誘発UVB耐性変異体イネ${it utr319}$の解析

高野 成央*; 高橋 祐子*; 山本 充*; 寺西 美佳*; 長谷 純宏; 坂本 綾子; 田中 淳; 日出間 純*

no journal, , 

イネのUVB耐性獲得にかかわる主因子の一つは、UVBによって誘発されるシクロブタン型ピリミジン二量体(CPD)を修復するCPD光回復酵素である。しかし、いまだUVB耐性機構の全容は明らかになっていない。これまでにわれわれはUVB耐性にかかわる因子の探索を目的に、UVB抵抗性イネ・ササニシキを親株とし、炭素イオンビーム(320MeV: $$^{12}$$C$$^{6+}$$, 80Gy)誘発UVB耐性変異${it utr319}$の選抜に成功し、解析を進めてきた。これまでの解析により、${it utr319}$は野生型と比較し、CPDの生成数(UVBの透過性)や修復活性には差がないことが明らかになっている。また、複製阻害剤やDNA損傷誘発剤に対しても野生型と比較して有為な差を示していないことから、${it utr319}$はDNA損傷への応答や修復等、これまでの研究でイネでのUVB耐性との関連が指摘されてきた因子とは異なる、未知な要因によるUVB耐性を獲得した可能性が高い。変原因遺伝子を明らかにするため、${it utr319}$の変異箇所の解析を行った結果、${it utr319}$は第7染色体の機能未知遺伝子2つを含む約45kbが欠失していることが明らかになった。本大会では欠失した遺伝子とUVB耐性との関連を踏まえ、${it utr319}$が獲得したUVB耐性機構について考察する。

口頭

DNA修復欠損植物における誘発突然変異スペクトルの解析

寺西 美佳*; 日出間 純*; 雑賀 啓明*; 土岐 精一*; 吉原 亮平*; 野澤 樹; 長谷 純宏; 坂本 綾子

no journal, , 

これまで「突然変異は偶発的に生じる」という立場から、目的の変異体獲得のためには最適な選抜条件の設定と選抜規模の拡大が必須とされてきた。しかし、「突然変異はDNA損傷に対して細胞内での修復機構が作用することで生じる」という点に着目すると、細胞内でのDNA修復機構を人為的に制御できれば、より自由に突然変異の効率や方向性をデザインできる可能性がある。そこで、このような新技術の開発のための第一歩として、シロイヌナズナのDNA修復欠損株を作製し、イオンビーム誘発変異における幾つかのDNA修復機構の果たす役割の解明を試みた。

口頭

イオンビームおよび$$gamma$$線の植物の相同組換え活性に及ぼす効果

坂本 綾子; 土岐 精一*; 日出間 純*

no journal, , 

イオンビームによって生じるDNA損傷は、修復の困難なクラスター損傷やDNA二本鎖切断が多いことが知られており、これらを修復するために誤りがちな修復機構である非相同末端結合(NHEJ)の経路が利用されると考えられている。しかし、植物のDNA修復機構にはこの他にも相同組換え(HR)などの経路があり、イオンビームを照射したときにどのようなメカニズムで修復が起こっているのかは明らかでない。そこで本研究では、HRの活性を検出する遺伝子マーカーを組み込んだシロイヌナズナを用い、$$gamma$$線およびイオンビーム照射によってこれらの活性が上昇するかどうかを解析した。一部が重複・分断した大腸菌$$beta$$グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子が挿入されたシロイヌナズナに対して15-25Gyの107MeV $$^{4}$$He$$^{2+}$$または25Gyの$$gamma$$線照射を行い、地上部のみを回収しGUS染色を行った。その結果、25Gyの$$gamma$$線照射でもわずかに組換え活性の上昇が見られたが、25Gyの$$^{4}$$He$$^{2+}$$ではより強いHR活性の誘導が検出された。15Gyの$$^{4}$$He$$^{2+}$$では、25Gyの$$gamma$$線と同程度のHR活性が検出された。このことから、$$^{4}$$He$$^{2+}$$は、同線量の$$gamma$$線よりもHRを誘導する活性が高いことが明らかになった。

口頭

シロイヌナズナにおけるイオンビーム誘発損傷の定量解析

寺西 美佳*; 山口 弘子*; 坂本 綾子; 日出間 純*

no journal, , 

放射線は生物のDNAに作用し、様々なDNA損傷(DNA鎖切断、酸化損傷など)を引き起こす。このDNA損傷の種類に応じて、機能する損傷修復機構が異なっており、修復機構の種類によって修復の正確さは異なっている。この正確さの違いが修復エラーにつながり、エラーの結果として生じる突然変異の違いにつながる。そのため、放射線照射によって誘発されるDNA損傷の種類と、その誘発頻度を定量的に解析することは、イオンビーム誘発突然変異のメカニズムを理解する上で重要である。そこで本研究では、イオンビームと$$gamma$$線によってシロイヌナズナに誘発されるDNA損傷を、二本鎖切断、一本鎖切断、酸化ピリミジン損傷に分け、定量した。その結果、野生型シロイヌナズナにおいて最も誘発されやすいDNA損傷は、カーボンイオンビームでは二本鎖切断、ヘリウムイオンビームと$$gamma$$線では一本鎖切断であった。発芽後7日齢のシロイヌナズナに照射した場合に第5葉の面積を50%減少させる線量(カーボンイオンビームは20Gy、$$gamma$$線は64Gy)で誘発されるゲノムあたりのDNA損傷数は、二本鎖切断がそれぞれ5.2個と8.3個、酸化ピリミジン損傷が2.6個と12.5個であった。酸化ピリミジン損傷は、$$gamma$$線でより多く誘発されており、吉原らにより報告されたG:CからA:TへのDNA変異頻度の上昇に関与する可能性が考えられた。

口頭

Analysis of DNA damages induced by ion beam, $$gamma$$ ray and UVB radiation in Arabidopsis

寺西 美佳*; 山口 弘子*; 坂本 綾子; 日出間 純*

no journal, , 

Radiation induce DNA damages, such as strand breaks, oxidative damage, and cyclobutane pyrimidine dimer (CPD) possibly resulting in an increased mutation frequency. Although it is important to know which DNA damage converted into a mutation, little is known about the types and extent of DNA damage induced by radiation in plant cells. We measured the number of DNA damages induced by ionizing radiation (carbon and helium ion beams, $$gamma$$ rays) and non-ionizing radiation (UVB) in Arabidopsis seedlings. The irradiated seedlings were harvested immediately and used for preparing an agarose plug, which were subjected to denature and non-denature agarose gel electrophoresis using static field electrophoresis and biased sinusoidal field gel electrophoresis. The number of DNA strand breaks were calculated using the molecular length standard curve and the quantity of DNA at each migration position as shown by the quantitative image data. As a result, irradiation of seedlings with 960 Gy of carbon ions resulted in up to 1.9 DNA double-strand breaks per megabase (Mb). Given that the total size of the Arabidopsis genome is 135 Mb, 960 Gy of carbon ions induce 257 DNA double-strand breaks per genome. Our results indicated that double-strand breaks were most inducible DNA damage by irradiation of carbon ions while single-strand breaks were most inducible by irradiation of helium ions and $$gamma$$ rays.

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