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reductase by X-ray crystallography; New insights into regulation of efficient electron transfer山田 貢*; 玉田 太郎; 竹田 一旗*; 松本 富美子*; 大野 拓*; 小杉 正幸*; 高場 圭章*; 正山 祥生*; 木村 成伸*; 黒木 良太; et al.
Journal of Molecular Biology, 425(22), p.4295 - 4306, 2013/11
被引用回数：24 パーセンタイル：52.10(Biochemistry & Molecular Biology)NADHシトクロム還元酵素(b5R)はNADHドメインとFADドメインの2つのドメインからなるフラボタンパク質で、NADHから二個の電子を受け取り、二分子のシトクロム(Cb5)に一電子ずつ伝達する反応を触媒する。今回、ブタ肝臓由来b5Rの還元型および酸化型の両状態における結晶構造解析に成功した。嫌気環境下で作製した結晶を用いて1.68
分解能で解析した二電子還元型b5Rの構造は、酸化型と比較して2つのドメインの相対配置がわずかに変化しており、その結果、FADの溶媒露出面積が増大し、FADのイソアロキサジン環のN5原子と、FADからのプロトン放出に関わっていると考えられているThr66の側鎖の水酸基間に水素結合が形成していた。一方、イソアロキサジン環の平面性は、還元型においても酸化型と変わらず保持されており、NAD
のニコチンアミド環とスタッキングしていた。また、0.78分解能で解析した酸化型b5Rの構造から、Thr66を介したFADとHis49間の水素結合ネットワークが水素原子の位置情報と共に明らかになった。これらの構造的特徴は、b5Rの触媒サイクルにおいて、電子の逆流を防ぎ、Cb5のような電子受容体への電子移動を促進するものであった。さらに、クライオトラップ法により還元型結晶の大気暴露時間を制御し作製した結晶を用いた解析により、還元型から酸化型への再酸化反応は二段階を経ることが示唆された。
木村 恒久*; 木村 史子*; 松本 賢司*; 目時 直人
Neutron Diffraction, p.179 - 202, 2012/03
構造解析その他に利用可能な3次元磁気配向結晶の育成技術と中性子散乱実験の結果について、現状を解説する。
木村 史子*; 木村 恒久*; 松本 賢司*; 目時 直人
Crystal Growth & Design, 10(1), p.48 - 51, 2009/12
被引用回数：14 パーセンタイル：75.44(Chemistry, Multidisciplinary)L-アラニン擬単結晶を三次元磁場配向により作成し、紫外線硬化性樹脂によって固めた。直径約8mm,高さ10mmの円筒形試料を中性子回折によって測定した。極点図は(120),(040)、及び(002)面でシャープなピークを示し、三次元配向を実証することができた。また、測定された積分強度は強度計算結果と良い一致を示した。本研究は大きな結晶が利用できない物質について、三次元磁場配向擬単結晶を育成することによって中性子回折による結晶構造解析が実現できる可能性について明らかにした。
還元酵素反応中間体のX線結晶構造解析山田 貢; 玉田 太郎; 松本 富美子; 竹田 一旗*; 木村 成伸*; 黒木 良太; 三木 邦夫*
no journal, ,
シトクロム還元酵素(以下R)は2ドメインからなり、ドメイン間に1個のFADを含み、NADHから電子を2つ受け取りシトクロムに伝達する酸化還元酵素である。本研究は還元型Rの結晶解析及び還元型Rから再酸化型Rへの時分割結晶解析によってRの酸化還元サイクルの詳細を解明することを目的とした。還元型Rの構造において、2つのドメインの相対位置が大きく変化していた。FADのイソアロキサジン環部位は折れ曲がらずに平面構造をとっておりNADとスタッキングしていたが、N10窒素は
型の幾何配置をとっていた。また、時分割解析の結果、Rはニコチンアミド部位を押し出す動きと、ADPリボース部位を押し出す動きの2つの動きによってNADを放出していことが明らかになった。上記の結果から、Rは(1)ドメインの相対位置変化によってシトクロム相互作用部位を作り出す機構、(2)FADH
とNADの電荷移動相互作用によって共鳴構造が壊れたFADHが安定化する機構、(3)電荷移動相互作用の消失に伴いニコチンアミド部位を活性中心から放出した後、ADPリボース部位を放出する機構の存在が示唆された。
reductase山田 貢; 玉田 太郎; 松本 富美子; 竹田 一旗*; 木村 成伸*; 黒木 良太; 三木 邦夫*
no journal, ,
シトクロム還元酵素(以下、b5R)は、NADHから二個の電子を受け取り、二分子のシトクロムに一電子ずつ伝達する酸化還元酵素である。本発表では二電子還元型b5R及び再酸化型b5Rの結晶解析の結果を報告する。二電子還元型b5R結晶の作製は、嫌気チャンバー内で実施し、SPring-8 BL38B1にて回折実験を行った。再酸化型b5R結晶は還元型結晶を大気暴露し作製した。二電子還元型b5Rの構造において、2つのドメイン配置が大きく変化し、FADの溶媒露出面積が増大した。また、FADのイソアロキサジン環は、折れ曲がらずに平面構造をとっておりNADとスタッキングしていた。さらに、FADからのプロトン放出にかかわっているとされるThr66は酸化型構造では、イソアロキサジン環のN5と水素結合を形成できない距離に位置していたが、二電子還元型においてはドメイン配置の変化によって水素結合を形成可能な位置に移動していた。一方、再酸化型b5Rでは大気暴露時間が少ないニコチンアミド部位の電子密度が一部不明瞭な構造(再酸化型1)と、ニコチンアミドが完全に消失した構造(再酸化型2)の2つを決定したこのことは、再酸化反応によってまずニコチンアミドが放出され、次いでADPリボースが放出される機構を示唆する。
山田 貢; 玉田 太郎; 松本 富美子; 竹田 一旗*; 木村 成伸*; 黒木 良太; 三木 邦夫*
no journal, ,
シトクロムb5還元酵素(以下、b5R)は、立体構造を構成する2つのドメイン間に1分子のFADを含み、NADHから二個の電子を受け取り、二分子のシトクロムb5に一電子ずつ伝達する酸化還元酵素である。二電子還元型b5R及び再酸化型b5Rの結晶解析によってb5Rの酸化還元サイクルにおける立体構造変化を解明する。二電子還元型b5Rの構造において、2つのドメイン配置が酸化型と比較して大きく変化し、FADのイソアロキサジン環は、平面のままNAD+とスタッキングしていた。さらに、b5Rの触媒サイクルにおいて重要な役割を果たすThr66は酸化型構造では、イソアロキサジン環のN5と水素結合を形成していないが、二電子還元型においては水素結合を形成可能な位置に移動していた。一方、再酸化型b5Rではニコチンアミド部位の電子密度が一部不明瞭な構造(再酸化型1)と、完全に消失した構造(再酸化型2)の2つを決定した。このことは、再酸化反応によってまずニコチンアミドが放出され、次いでADPリボースが放出される機構を示唆する。得られた還元型及び再酸化型b5Rの構造学的情報は、b5Rの機能を理解するうえで有用な知見である。
reductase by X-ray crystallography玉田 太郎; 山田 貢*; 竹田 一旗*; 松本 富美子*; 木村 成伸*; 黒木 良太; 三木 邦夫*
no journal, ,
NADHシトクロム還元酵素(b5R)はNADHドメインとFADドメインの2つのドメインからなるフラボタンパク質で、NADHから二個の電子を受け取り、二分子のシトクロム(Cb5)に一電子ずつ伝達する反応を触媒する。嫌気環境下で作製した結晶を用いて1.68分解能で解析した二電子還元型b5Rの構造は、酸化型と比較して2つのドメインの相対配置がわずかに変化しており、その結果、FADの溶媒露出面積が増大し、FADのイソアロキサジン環のN5原子と、FADからのプロトン放出に関わっていると考えられているThr66の側鎖の水酸基間に水素結合が形成していた。一方、イソアロキサジン環の平面性は、還元型においても酸化型と変わらず保持されており、NADのニコチンアミド環とスタッキングしていた。これらの構造的特徴は、b5Rの触媒サイクルにおいて、電子の逆流を防ぎ、Cb5のような電子受容体への電子移動を促進するものであった。さらに、クライオトラップ法により還元型結晶の大気暴露時間を制御し作製した結晶を用いた解析により、還元型から酸化型への再酸化反応は二段階を経ることが示唆された。
