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-lactamaseのCs
選択性結合部位の発見新井 栄揮; 柴崎 千枝; 清水 瑠美; 安達 基泰; 玉田 太郎; 徳永 廣子*; 石橋 松二郎*; 徳永 正雄*; 黒木 良太
九州シンクロトロン光研究センター年報,2014, p.17 - 19, 2016/03
タンパク質は生物の生命活動のために、金属イオンの電荷数の違いやイオン半径のわずかな違いを識別して結合するなど、緻密な原子・分子認識機構を有する。多くのタンパク質が必須元素の金属を結合することは広く知られている。しかし、タンパク質が必須元素ではないセシウム(Cs)を選択して結合しうるのか、また、その結合部位はどのような構造をしているのか等は明らかにされていなかった。特に、東京電力福島第一原子力発電所事故によって放出された放射性Csの生物への影響を知るためや、タンパク質を利用したCs吸着剤を開発するためには、タンパク質におけるCsの結合のしやすさや結合部位の構造を解明することが重要と考えられた。そこで我々は、好塩性タンパク質とCsの相互作用の研究に着手した。好塩性タンパク質は、塩湖・岩塩・塩蔵食品・発酵食品などの高塩濃度環境に生息する好塩性細菌が作るタンパク質である。好塩性タンパク質は、高塩濃度環境に適応するために多く酸性アミノ酸を含有し、多くの負電荷を有することから、Csを含む様々な金属イオンを結合する可能性があると我々は考えた。本研究では、好塩性タンパク質の中でも比較的高い酸性アミノ酸含量を有し[(Asp + Glu) / (Arg + Lys) = 2.11]、かつ、大腸菌への遺伝子組換えによって大量調製が可能な好塩菌
sp. 560由来-lactamase (以下、HaBLA)について、立体構造の解明とCs結合部位の検出を試みた。
sp. AS-131 isolated from Antarctic Ocean米澤 悌*; 永山 あい子*; 徳永 廣子*; 石橋 松二郎*; 新井 栄揮; 黒木 良太; 渡邉 啓一*; 荒川 力*; 徳永 正雄*
Protein Journal, 34(4), p.275 - 283, 2015/08
被引用回数：4 パーセンタイル：11.12(Biochemistry & Molecular Biology)好冷菌 sp. AS-131由来ヌクレオシド二リン酸キナーゼ(ASNDK)の大腸菌による発現、および、精製に成功した。通常細菌由来ヌクレオシド二リン酸キナーゼと比較して、ASNDKは、(1)37
Cの大腸菌発現では変性した不溶性の状態で発現する。(2)活性の至適温度は30C低い。など、熱的に不安定な特徴を有していた。また、ASNDKは、中度好塩菌由来ヌクレオシド二リン酸キナーゼのような二量体構造を形成することが示唆された。
-lactamase from the moderate halophile sp.560 and the discovery of a Cs-selective binding site新井 栄揮; 米澤 悌*; 岡崎 伸生*; 松本 富美子*; 柴崎 千枝; 清水 瑠美; 山田 貢*; 安達 基泰; 玉田 太郎; 河本 正秀*; et al.
Acta Crystallographica Section D, 71(3), p.541 - 554, 2015/03
被引用回数：7 パーセンタイル：50.76(Biochemical Research Methods)蛋白質を利用した希少・有害金属捕集材料の研究開発の一環として、中度好塩菌Chromohalobacter sp.560由来・高酸性-Lactamase(HaBLA)のX線結晶構造を解明するとともに、X線異常分散測定により、HaBLA分子上のCs, Sr
結合部位の抽出を試みた。PFのNW3AにてHaBLAのX線結晶構造を解明した後、Cs吸収端(
=2.175
)近傍のX線を利用できるSAGA-LSのBL7やPFのBL17A、及び、Sr吸収端(=0.770)近傍のX線を利用できるSPring-8のBL38B1やPFのBL5Aなどを使用して、HaBLA分子に結合したCs及びSrを同定した。その結果、HaBLA分子上に少なくとも1ヶ所のCs結合部位、3ヶ所のSr結合部位を発見した。特に、今回発見したCs結合部位は、NaがCsの9倍量存在する条件下(Na/Cs = 90mM/10mM)でもCsを選択的に結合できることが明らかになった。このCs選択的結合部位は、Trp側鎖のベンゼン環によるカチオン-
相互作用、および、主鎖の2つの酸素原子によってCsを結合していた。本研究で得たCs結合部位の立体構造情報は、原発事故によって放出された放射性Csを捕集する蛋白質材料の設計(人工的Cs結合部位の設計)の土台として利用できる。
sp.593新井 栄揮; 米澤 悌*; 石橋 松二郎*; 松本 富美子*; 安達 基泰; 玉田 太郎; 徳永 廣子*; Blaber, M.; 徳永 正雄*; 黒木 良太
Acta Crystallographica Section D, 70(3), p.811 - 820, 2014/03
被引用回数：12 パーセンタイル：63.07(Biochemical Research Methods)中度好塩菌 sp.593のペリプラズム蛋白質Alkaline phosphatase(HaAP)は、他の好塩性Alkaline phosphataseと異なり、幅広い塩濃度域(1
4M NaCl)において機能発現が可能である。そこで本研究では、HaAPの構造学的特徴と好塩性の関係を理解するために、HaAPのX線結晶解析を行った。分解能2.1, 空間群
2
, 格子定数
=52.7, 
=147.0, 
=58.3, 
=90, =105.2, 
=90, R
8.4%の回折データを取得して、生物学的構造単位であるHaAP二量体の立体構造を解明することに成功した。また、HaAPの立体構造を、PDB中で最も配列相同性が高い低度好塩菌
sp.由来VAP(identity 70.0%)の立体構造と比較した。その結果、ASA
0 
の酸性アミノ酸(D, E)の数は、VAP(57個)よりもHaAP(72個)が多いことが明らかになった。また、VAPとHaAPを構成する疎水性アミノ酸(V, L, I, P, F, M, W)に着目すると、二量体界面に位置する疎水性アミノ酸の数はほぼ同じ(39個と40個)であったが、分子内部(ASAが0)の疎水性アミノ酸はそれぞれ24個と37個であった。このようなHaAPにおける分子表面の高い酸性アミノ酸含量や分子内部の高い疎水性アミノ酸含量は、中度好塩菌のペリプラズム特有の幅広い塩濃度環境下(0.5M飽和塩濃度)における高い可溶性と機能発現の両立に寄与していると考えられる。
安達 基泰; 新井 栄揮; 廣本 武史; 黒木 良太
波紋, 24(1), p.45 - 49, 2014/02
中性子回折を使った蛋白質の構造解析は、生体高分子の構造と機能の関係を理解する上においてますます重要になっている。原子力機構の研究用原子炉およびパルス中性子施設に設置した中性子回折計の近年の発達したことによって、水和水と生体高分子の水素原子を観察することが可能となり、化学反応の機構を解明するための重要な知見が得られるようになった。ここでは、生体高分子の中性子結晶構造解析のための、試料調製、結晶成長、構造解析と得られる情報の利用について例を挙げ概説する。
三枝 純; 操上 広志; 安田 良; 栗原 和男; 新井 栄揮; 黒木 良太; 松橋 信平; 小澤 隆志; 後藤 浩明; 高野 隆夫; et al.
Health Physics, 104(3), p.243 - 250, 2013/03
被引用回数：3 パーセンタイル：25.73(Environmental Sciences)2011年3月の原子力発電所事故を受け、福島県内の多くの学校プールでは、放射性セシウムを含んだ水が農地に放出されることへの懸念から、プール水が排水できないままにあった。原子力機構では、プール水を除染するための方法として、各種のセシウム吸着材を使った方法や凝集沈殿法について調査・検討を行った。この結果をもとに、福島県内の学校プールにおいて除染の実証試験を行い、手法の見直しや改良を進めることにより、プール水の除染方法を構築した。
丹羽 秀治*; 斎藤 信*; 小林 正起*; 原田 慈久*; 尾嶋 正治*; 守屋 彰悟*; 松林 克征*; 難波江 裕太*; 黒木 重樹*; 池田 隆司; et al.
Journal of Power Sources, 223, p.30 - 35, 2013/02
被引用回数：18 パーセンタイル：50.94(Chemistry, Physical)固体高分子形燃料電池用の非白金で、安価で、高性能の炭素正極触媒をデザインするには、酸素還元反応の活性点を明らかにすることが重要である。しかしながら、このような複雑な系においては通常用いられる原子・電子構造プローブにより活性点を直接特定するのは困難である。本研究では、炭素1
X線吸収分光を用いて鉄フタロシアニンをもとにした触媒の炭素構造を観察し、
吸収端以下に炭素端の露出を意味する構造を見いだした。またその強度は酸素還元活性とよく相関することがわかった。これらの結果は、炭素1X線吸収分光を用いることにより炭素正極触媒における酸素還元活性の評価が端の露出の観点から可能であることを示している。
木内 久雄*; 丹羽 秀治*; 小林 正起*; 原田 慈久*; 尾嶋 正治*; 畳開 真之*; 難波江 裕太*; 黒木 重樹*; 柿本 雅明*; 池田 隆司; et al.
Electrochimica Acta, 82(1), p.291 - 295, 2012/10
被引用回数：14 パーセンタイル：34.42(Electrochemistry)含窒素ポリアミド(PA)と窒素を含まないフェノール樹脂(PhRs)由来の金属を含まない炭素触媒への酸素吸着特性を調べた。電気化学分析及びラマン分光からPA由来の炭素触媒はPhRs由来の物よりもより高い2電子酸素還元活性を示し、またより多くの欠陥を含むことがわかった。
X線光電子分光からグラファイト状窒素が酸素吸着に寄与しPA由来の触媒ではC=Oが主な成分であることがわかった。これらの実験結果はグラファイト状窒素の近傍に吸着したC=O成分が2電子酸素還元の活性点であることを示唆している。
1-tetrahydrocannabinolic acid (THCA) synthase, the enzyme controlling the psychoactivity of 
正山 祥生*; 玉田 太郎; 栗原 和男; 竹内 彩子*; 田浦 太志*; 新井 栄揮; Blaber, M.*; 正山 征洋*; 森元 聡*; 黒木 良太
Journal of Molecular Biology, 423(1), p.96 - 105, 2012/10
被引用回数：82 パーセンタイル：89.24(Biochemistry & Molecular Biology)1-テトラヒドロカンナビノール酸(THCA)合成酵素は、基質であるカンナビゲロール酸の酸化的閉環反応を触媒し、大麻の幻覚活性をつかさどる1-テトラヒドロカンナビノールの前駆体であるTHCAを合成する。本研究では、THCA合成酵素のX線結晶解析及び変異体を用いた活性測定を実施し、THCA合成酵素の機能-構造相関の解明を試みた。2.75分解能で決定した立体構造情報に変異体解析結果を組合せことにより、THCA合成酵素の活性に寄与する残基を同定した。
石橋 松二郎*; 内野 真奈美*; 新井 栄揮; 黒木 良太; 荒川 力*; 徳永 正雄*
Archives of Biochemistry and Biophysics, 525(1), p.47 - 52, 2012/09
被引用回数：7 パーセンタイル：20.98(Biochemistry & Molecular Biology)高度好塩菌Halobacterium salinarum由来ヌクレオシド二リン酸キナーゼ(HsNDK)は、立体構造の安定化に高濃度の塩を必要とする。しかし、アスパラギン酸148番目をシステインに置換したD148C変異型HsNDKは、0.2M NaClの低塩濃度条件下において野生型HsNDKよりも10C以上熱安定性が向上することが判明した。また、熱変性後の巻き戻りには、野生型では2M NaClを必要とするのに対し、D148C変異型では0.1M NaClで巻き戻ることができた。HsNDKは二量体どうしが会合した六量体構造を形成するが、D148C変異導入は六量体内の二量体間に3か所のジスルフィド架橋を形成させて構造を安定化し、本来構造安定化に必要な塩要求性を低減することができたと考えられる。
sp. nucleoside diphosphate kinase新井 栄揮; 米澤 悌; 岡崎 伸生; 松本 富美子; 玉田 太郎; 徳永 廣子*; 石橋 松二郎*; Blaber, M.; 徳永 正雄*; 黒木 良太
Protein Science, 21(4), p.498 - 510, 2012/04
被引用回数：14 パーセンタイル：34.5(Biochemistry & Molecular Biology)さまざまな生物種で保存されているヌクレオシドニリン酸キナーゼ(NDK)は、4量体もしくは6量体構造を形成することが知られる。一方、中度好塩菌 sp. 593由来NDK(HaNDK)はNDKとしては例外的に2量体を形成し、E134A変異導入により4量体へ変換される。本研究では、ゲルろ過光散乱及びX線結晶解析により、中度好塩菌 sp. 593由来NDKにおけるE134A変異導入による多量体変換の機構を解明した。また、E134A変異型HaNDKの結晶中には、グラム陰性菌由来MxNDKに類似した4量体構造と大腸菌由来EcNDKに類似した4量体構造が交互に現れることを明らかにした。一般に蛋白質は会合することで熱安定性や基質親和性を増大することから、少ない変異導入による多量体構造の変化は、NDKがさまざまな環境に適合するために有効に寄与している可能性がある。
DSM3043; Both residues 134 and 136 are critical for the tetramer assembly徳永 廣子*; 伊豆津 健一*; 新井 栄揮; 米澤 悌; 黒木 良太; 荒川 力*; 徳永 正雄*
Enzyme and Microbial Technology, 46(2), p.129 - 135, 2010/02
被引用回数：6 パーセンタイル：20.75(Biotechnology & Applied Microbiology)本論文では中度好塩菌由来CsNDKの多量体構造にかかわる134及び136番目残基の役割について議論する。CsNDKのGly134やGlu136をAlaやThrに置換した数種類の変異蛋白質を調製し、それらの会合状態を比較した結果、134及び136番目残基の両者がCsNDKのサブユニットの会合に寄与していることが明らかになった。Gly134をAla、Glu136をThrに置換したCsNDK/ANTでは、Ala134が疎水性クラスターを形成することで二量体-二量体の会合が安定化することが判明した。
安達 基泰; 大原 高志; 栗原 和男; 玉田 太郎; 本庄 栄二郎; 岡崎 伸生; 新井 栄揮; 正山 祥生; 木村 要*; 松村 浩由*; et al.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 106(12), p.4641 - 4646, 2009/03
被引用回数：111 パーセンタイル：90.72(Multidisciplinary Sciences)本研究では、プロテアーゼとその医薬品候補分子との分子間相互作用を原子レベルで解明することを目的として、阻害剤との複合体の中性子結晶構造解析を実施した。タンパク質の中性子結晶構造解析を行うには、高品質な大型結晶作成のために大量のタンパク質試料が必要となる。本研究では、コドン配列を最適化した人工遺伝子を合成することで効率的な大腸菌発現系を構築し、プロテアーゼの大量調製系を確立した。そして逆相クロマトグラフィーを用いることで自己分解物を完全に除去した純度の高い試料を調製して結晶化を行った。得られた結晶を用いてJRR-3に設置しているBIX-4にて中性子回折データを収集した結果、1.9の回折データを得ることができた。プログラムPHENIXにより中性子とX線の同時精密化を実施し、世界で初めてHIV-1プロテアーゼの中性子結晶構造解析に成功した。重水素原子の存在と位置を確認するためにオミットマップを作成したところ、顕著な2つのピークを得た。プロトン化された触媒残基及び阻害剤のヒドロキシル基の構造を水素原子を含めて実験で初めて明らかにすることができた。
徳永 廣子*; 石橋 松二郎*; 有坂 文雄*; 新井 栄揮; 黒木 良太; 荒川 力*; 徳永 正雄*
FEBS Letters, 582(7), p.1049 - 1054, 2008/04
被引用回数：17 パーセンタイル：40.45(Biochemistry & Molecular Biology)ヌクレオシド二リン酸化キナーゼ(NDK)は、中度好塩菌由来HaNDKの場合は2量体を形成し、通常細菌
由来PaNDKの場合は4量体を形成する。しかし、HaNDKのGlu134にAlaを変異導入すると4量体を形成するようになり、PaNDKのAla134にGluを変異導入すると2量体を形成するようになった。この結果は、134番目のアミノ酸一残基のみの置換でNDKの複合体構造を変換できることを意味する。中度好塩菌
由来NDKの結晶構造に基づいて作製したHaNDKとPaNDKの分子モデルからは、Glu134による反発的相互作用が4量体中の2量体-2量体間の分裂を促すことが判明した。
玉田 太郎; 新井 栄揮; 本庄 栄二郎; 黒木 良太
no journal, ,
X線結晶構造解析では1
以上の高分解能でなければ決定できない水素原子の位置決定を、中性子結晶構造解析では通常の分解能(2程度)で容易に決定できる。よって、中性子解析による蛋白質の構造情報から蛋白質を取り巻く水和水の構造や水素結合・プロトン化の状態などの興味深い情報が得られる。しかしながら、中性子線の強度がX線と比べてはるかに弱く回折データ収集には少なくとも数mm
以上の大きさの結晶を必要とすることから、これまでの中性子解析は「水素・水和水がその機能発現に重要な役割を果たす」蛋白質よりも「大きな結晶ができやすい」蛋白質がその解析対象であった。「水素・水和水がその機能発現に重要な役割を果たす」蛋白質を対象とした研究に取り組むために、われわれは「効果的な大型結晶作成技術の開発」,中性子解析に必要な結晶サイズを小さくするために「完全重水素化試料の作成」に取り組んでいる。これらの課題克服により、中性子解析がめざすべき重要な研究対象の1つは「創薬対象蛋白質」である。実験的に取得した水素・水和情報を加えることによりラショナルなドラッグデザインの精度が上がることが期待される。これまでに中性子及び超高分解能X線解析により得られた水素・水和情報をわれわれはデータベース化し公開した。また、創薬ターゲットであるセリンプロテアーゼ及び阻害剤複合体の中性子回折実験も開始した。われわれの試みはまだその諸についたばかりであるが、これまでに得られた結果、及び今後の展開を紹介する。
玉田 太郎; 本庄 栄二郎; 新井 栄揮; 黒木 良太
no journal, ,
タンパク質の立体構造情報が集積される一方で、受容体のような膜タンパク質の構造情報は遅れがちである。細胞の表層に発現する受容体は、創薬における重要な標的であることが知られるが、その多くは一般的に不安定でプロテアーゼ消化されやすく、付加した糖鎖による不均一性から、構造解析の対象となりにくかった。そこでわれわれはこれらのタンパク質を効果的に結晶化させるため、抗体、特にFabフラグメントとの共結晶化研究を行っている。抗体を用いる結晶化では、膜タンパク質だけではなく他の結晶化しにくいタンパク質に対しても応用可能であるため、関連する技術やノウハウの集積はタンパク3000プロジェクトの目標と合致する。また、抗体自身を種々の産業用途に用いることができるため、産業応用面においても重要な研究である。これまでに目的タンパク質を結晶化するための抗体としてマウスやヒト由来の抗体を用いた結晶化研究を行っている。結晶化用抗体として、IgGやFabあるいはscFv等が考えられるが、われわれの検討結果から結晶化にはFabを用いることが最適であると判断した。本発表では立体構造認識抗体の取得法,IgGからFabの確実な調製法,Fab複合体の結晶化条件の特徴,Fabを用いた新規タンパク質の結晶化事例などを紹介する。
HA1-2mAb由来Fab; 抗原ペプチド複合体のX線結晶解析新井 栄揮; 玉田 太郎; 岡村 好子*; 一二三 恵美*; 宇田 泰三*; 黒木 良太
no journal, ,
インフルエンザウイルスの感染は、ウイルス表面の糖蛋白質・ヘマグルチニン(HA)が宿主細胞膜上のガングリオシドやシアル酸含有糖蛋白質受容体へ結合することで始まる。HAは非常に変異しやすく、これがインフルエンザ予防を困難にしている。われわれは、H1型(スペイン風邪,ソ連風邪)やH2型(アジア風邪)ウイルスにおけるHAのアミノ酸配列中に変異しない保存領域を見いだし、その領域に特異的に結合・分解するHA1-2モノクローナル抗体(HA1-2mAb)を開発した。この抗体は抗原を特異的に認識し分解する酵素活性を有しており、「抗体酵素」として新規医薬品・検査診断薬・バイオセンサ開発などへの応用を進めている。われわれはHA1-2mAbの触媒機構を明らかにするために、HA1-2mAb由来Fabと抗原ペプチドの複合体のX線結晶解析を行った。抗体をパパイン消化しFabを調製した後、抗原ペプチド(HAのアミノ酸配列保存領域を含み、18アミノ酸残基から成る)を混合して複合体を調製し、結晶を作製した。X線回折測定では最大分解能2.9, completeness 96.8%, R-merge 6.6%の回折データを取得した。このデータを用いて分子置換法による構造解析を行ったところ、(1)抗体酵素由来のFabは他のFabとほとんど同じ立体構造をとることや、(2)FabのH鎖とL鎖間のCDR領域付近にペプチドが存在することが確認された。現在触媒基の候補となるアミノ酸残基の同定を実施している。
新井 栄揮; 玉田 太郎; 前田 宜丈*; 黒木 良太
no journal, ,
マウス抗体TN1は、巨核球系細胞の増殖・分化及び血小板産生を促進するサイトカインであるヒト・トロンボポエチン(hTPO)を認識する。TN1抗体のTPO中和活性は、TPOによるTPO受容体の二量体化が阻害されるからであると考えられている。本研究では、抗原との結合によるTN1の構造変化を調べるために、TN1由来FabのX線結晶構造解析を2.1分解能で決定し、TN1-Fab/hTPO複合体(PDB id 1V7M)のFabと比較を行った。その結果、TN1由来Fabを構成している各構造ドメインは、抗原認識部位である超可変領域(CDR領域)を含め、抗原結合時・非結合時においてほとんど変化が見られなかった(rms deviation 
0.6)。抗原結合時と比較して、非結合時は可変領域・一定構造領域の相対位置がわずかにずれるが、これは結晶中の分子のパッキングの差によるものと思われる。これらの結果は、TN1由来Fabが抗原との結合の際に構造変化を必要としないことを示唆する。
新井 栄揮; 玉田 太郎; 前田 宜丈*; 黒木 良太
no journal, ,
マウス抗体TN1は、巨核球系細胞の増殖・分化及び血小板産生を促進するサイトカインであるヒト・トロンボポエチン(hTPO)を認識する。われわれは、TN1抗体によるhTPO中和活性の発現機構の解明のために、TN1由来Fab単体のX線結晶構造を2.1オングストローム分解能で決定し、TN1由来Fab-hTPO複合体中のFabの構造と比較した。その結果、TN1抗体によるhTPO認識は、超可変領域(CDR領域)の主鎖構造がほとんど変化せず、ごくわずかに生じた側鎖レベルでのInduced-fitに基づくことが明らかになった。一方、抗原結合時と比較して、非結合時はFabのFv領域
C1領域の相対位置が大きくずれることも明らかになった。(抗原結合・非結合時のFab全体のCを比較すると、RMSDは2.4オングストロームである。)本発表では、Fabの構造解析結果を詳細に報告するとともに、抗原結合・非結合時におけるFabの構造変化について、結晶内分子のパッキングの影響などに着目して議論する。
新井 栄揮; 玉田 太郎; 本庄 栄二郎; 前田 宜丈*; 黒木 良太
no journal, ,
マウス抗体TN1は、巨核球系細胞の増殖・分化及び血小板産生を促進するサイトカインであるヒト・トロンボポエチン(hTPO)を認識する。われわれは、TN1抗体によるhTPO中和活性の発現機構の解明のために、TN1由来Fab単体のX線結晶構造を2.0分解能で決定し、TN1由来Fab-hTPO複合体中のFabの構造と比較した。その結果、TN1抗体によるhTPO認識は、超可変領域(CDR領域)の主鎖構造がほとんど変化せず、ごくわずかに生じた側鎖レベルでのInduced-fitに基づくことが明らかになった。また、TN1由来Fab-hTPOの結合反応について等温滴定熱量測定を行った結果、2,920 の接触面積変化に相当する446.4kJ/mol/Kの構造エントロピー変化が観測された。この結果は、上記結晶構造解析の結果から判明している接触面積変化の値(1,580 )よりも大きい。FabのCDRの構造はほとんど変化しないことから、この接触面積変化の差はFabの結合によってhTPOの構造変化が生じていることを示唆する。
