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論文

Improvement of symbiotic performance of ${it Sinorhizobium}$ with ${it Vigna marina}$ under high salt conditions using the ion beam mutation breeding

丸山 雄大*; 武田 喜代子*; 友岡 憲彦*; 佐藤 勝也; 大野 豊; 横山 正*

JAEA-Review 2015-022, JAEA Takasaki Annual Report 2014, P. 99, 2016/02

${it Vigna marina}$ is one of wild legumes, which called as Hamaazuki, are distributed at the vicinity of the coast from tropical to sub-tropical regions and have high salt tolerance among terrestrial plants. ${it V. marina}$ can grow at 400 mM NaCl condition. Furthermore, the root nodules on ${it V. marina}$ have a symbiotic relationship with rhizobia that related to the genus ${it Sinorhizobium}$ having high stress tolerance (500 mM NaCl, 45 $$^{circ}$$C, pH 10.5). Above both symbiotic partners showed extremely high salt tolerance, however, ${it V. marina}$ cannot develop root nodules with ${it Sinorhizobium}$ at over 80 mM NaCl conditions. To improve symbiotic performance of ${it V. marina}$ with ${it Sinorhizobium}$ under high salt conditions, ${it Sinorhizobium}$ bacterial cells were irradiated by carbon ion-beam at TIARA. However, so far, we could not obtain promising mutants having good symbiotic performance with Vigna marina under high salt conditions, yet.

論文

Breeding of high ethanol producing yeast by screening from mutant library

荻野 千秋*; Kahar, P.*; Lee, J. M.*; 佐藤 勝也; 大野 豊; 近藤 昭彦*

JAEA-Review 2015-022, JAEA Takasaki Annual Report 2014, P. 105, 2016/02

Ethanol fermentation from hydrolyzed lignocellulosic biomass with yeast is very important. However, in common sense, there are several chemical inhibitors for yeast from hydrolyzed biomass. Therefore, screening of yeast strain, possessing the tolerance properties against these chemical inhibitors, should be found from nature resources or mutant libraries. To overcome the problem, we have screened yeast strains tolerant to many chemical inhibitors contained in bagasse sugar lysate (BSL) at high temperature (35 $$^{circ}$$C) from 1500 strains out of national bio-resource center yeast collection. We found that F118 strain could grow and ferment BSL and produce ethanol. For increasing of the yield and ethanol fermentation efficiency of F118 strain, the adaptation of F118 strain to high temperature was conducted, followed by carbon ion beam irradiation. Consequently, we have successfully obtained F118S88 strain as a good candidate for ethanol production from BSL at high temperature.

論文

イオンビーム育種により得られた高カプロン酸エチル生産清酒酵母のゲノム配列解析,2

増渕 隆*; 渡口 和樹*; 林 秀謙*; 池永 裕*; 佐藤 勝也; 大野 豊

JAEA-Review 2015-022, JAEA Takasaki Annual Report 2014, P. 106, 2016/02

We conducted the gene function analysis of the high ethyl caproate producing sake yeast mutant (No.227) generated by ion beam breeding in order to develop a new method for sake yeast screening and find factors contributing the reduced ability to alcohol fermentation. The genome sequences of the No.227 and Kyokai 901 (its parental strain) were determined by a whole-genome shotgun strategy using pyrosequencing method. And the determined sequences were compared with that of the sake yeast strain Kyokai 7, which is characterized by the fermentation properties. Consequently, the No.227 carried mutations in the ${it FAS2}$ and ${it ERR2}$ genes as heterozygous state. It was suggested that these mutations in the ${it FAS2}$ and ${it ERR2}$ genes in the No.227 might be attributed to the high ethyl caproate production and the low alcohol fermentation ability, respectively.

論文

Genome analysis of the high temperature tolerant mutant of ${it Bradyrhizobium japonicum}$ USDA110 generated by ion-beam irradiation

武田 喜代子*; 佐藤 勝也; 鳴海 一成*; 大野 豊; 大津 直子*; 横山 正*

JAEA-Review 2014-050, JAEA Takasaki Annual Report 2013, P. 120, 2015/03

Major constraint of biofertilizer utilization in agricultural practice is a viability loss of beneficial microorganisms in biofertilizers by high temperature stress during both storage and transportation. Therefore, we have tried to improve high temperature tolerance of ${it Bradyrhizobium japonicum}$ USDA110 using carbon-ion beams accelerated by an AVF cyclotron at TIARA. Consequently, we have obtained a high temperature tolerant mutant that can maintain a high survival rate at 42 $$^{circ}$$C for at least 7 days in yeast-mannitol broth medium, and named it as M14. The genome sequence of M14 was determined by a whole-genome shotgun strategy. The acquirement of high temperature tolerance in M14 could be attributed to 18 base mutations and/or a large-scale inversion (1.27 Mb). In the future, we will conduct further analysis on these mutations in order to decipher the molecular mechanisms of high temperature tolerance of M14.

論文

Thermotolerant mutants of entomopathogenic fungi obtained by ion beam- and $$gamma$$ ray-induced mutagenesis

西東 力*; Fitriana, Y.*; 佐藤 勝也; 大野 豊; 鳴海 一成*

JAEA-Review 2014-050, JAEA Takasaki Annual Report 2013, P. 121, 2015/03

Entomopathogenic fungi, such as ${it Metarhizium anisopliae}$, are economically important agents for integrated pest management programmes of insect pests. However, negative effects of temperature, such as heat stress that exceeds 35 $$^{circ}$$C, can have serious deleterious effects on conidial germination and persistence, vegetative growth, sporulation, and/or the infection process in these entomopathogenic fungi. In this study, we attempted to enhance thermotolerance in a model entomopathogenic fungus, ${it M. anisopliae}$, by mutagenesis using ion beams or $$gamma$$ rays and evaluated the relative virulence of the resulting mutants compared with the wild-type isolates. In conclusion, ion beams and $$gamma$$ rays are useful tools for improving biological characteristics, such as thermotolerance and fungicide-tolerance, in entomopathogenic fungi, but the mutants obtained in this study must be carefully evaluated for unpredictable negative side effects.

論文

Screening of yeast strain for ethanol fermentation after carbon ion beam irradiation

荻野 千秋*; 山田 良祐*; 佐藤 勝也; 大野 豊

JAEA-Review 2014-050, JAEA Takasaki Annual Report 2013, P. 122, 2015/03

Ethanol fermentation from hydrolyzed lignocellulosic biomass with yeast is very important. However, in common sense, there are several chemical inhibitors for yeast from hydrolyzed biomass. Therefore, screening of yeast strain, possessing the tolerance properties against these chemical inhibitors, should be found from nature resources or mutant libraries. In this research, by carbon ion beam irradiation, the screening of candidate yeast strains was performed. Compared with wild type strain, the ethanol production yield was improved in the case of selected strain. It was assumed that the carbon ion beam irradiation could be influence to yeast cell, and improve the metabolic pathway. In future, by using this selected yeast, the ethanol fermentation from hydrolyzed biomass with high efficiency would be performed.

論文

Genome analysis of high ethyl caproate producing sake yeasts generated by ion beam breeding

増渕 隆*; 日向 弘和*; 上田 涼史郎; 林 秀謙*; 池永 裕*; 佐藤 勝也; 大野 豊

JAEA-Review 2014-050, JAEA Takasaki Annual Report 2013, P. 123, 2015/03

We analyzed genome sequence of the high ethyl caproate producing sake yeast mutant (No.227) generated by ion beam breeding in order to investigated factors contributing the reduced ability to alcohol fermentation. In the high ethyl caproate producing sake yeast, four pyruvate decarboxylase genes (PDC), six alcohol dehydrogenase genes (ADH), two biotin synthesis genes (BIO) and chitinase gene (CTS1) might be involved in the reduced ability to alcohol fermentation. The genome sequence of the strain No.227 was determined by a whole-genome shotgun strategy using pyrosequencing method and compared with the whole-genome sequence of the sake yeast strain Kyokai 7, which is characterized by the fermentation property, as a reference sequence. For the PDC, ADH, BIO and CTS1 loci, no mutation was found in the strain No.227, suggesting that these genes did not involved in the reduced ability to alcohol fermentation.

論文

Benomyl-resistant ${it Beauveria bassiana}$ (Hypocreales: Clavicipitaceae) mutants induced by ion beams

Fitriana, Y.*; 篠原 忍*; 佐藤 勝也; 鳴海 一成*; 西東 力*

Applied Entomology and Zoology, 50(1), p.123 - 129, 2015/02

 パーセンタイル:100(Chemistry, Physical)

Fungicides targeted at phytopathogens can be harmful to entomopathogenic fungi. The purpose of this study was to use ion-beam irradiation technology to produce benomyl-resistant mutants of the entomopathogenic fungus ${it Beauveria bassiana}$. After irradiation of conidia at 150 Gy, two mutant isolates, BB22 and BB24, were selected on media containing the fungicide. In an assay of vegetative growth, BB22 and BB24 were over 500 and 800 times more tolerant to benomyl, respectively, compared with the wild isolate. A mutation was found at position 198 of the $$beta$$-tubulin gene in the mutant isolates, with a substitution of glutamate for alanine (E198A). Ion beams have great potential as a tool to improve the traits of entomopathogenic fungi such as increasing tolerance to fungicides. Fungicide-resistant mutants produced in this way could be useful agents for biological control within IPM programmes where fungicides are also used.

口頭

イオンビーム育種により作出したダイズ根粒菌高温耐性変異株の大規模なゲノム構造変異と少数の塩基変異

武田 喜代子*; 佐藤 勝也; 大野 豊; 鳴海 一成*; 大津 直子*; 横山 正*

no journal, , 

現在、化学肥料からの脱却を目指し、東南アジア等では根粒菌を用いたバイオ肥料の利用を奨励している。しかし、化学肥料とは異なり、輸送や保存時の高温による接種菌の活性低下等の問題があり改良が望まれている。これまで我々は、ダイズ根粒菌の優良接種菌株である${it Bradyrhizobium japonicum}$ USDA110株を対象とした、イオンビーム突然変異育種を行ってきた。そして、42$$^{circ}$$CのYM液体培地内で少なくとも1週間は高い生存率を保つことができる高温耐性変異株の取得に成功した。本研究では、次世代シークエンサーを用いて高温耐性変異株の全ゲノムを解読し、野生株との塩基配列の比較によって高温耐性変異株において、1.27Mbpの逆位という大規模なゲノム構造変異、及び一塩基置換・欠失及び挿入などの18ヶ所の小規模なDNA塩基変異が存在することを明らかにした。

口頭

量子ビーム照射によって作出された昆虫病原糸状菌高温耐性変異体

西東 力*; Fitriana, Y.*; 佐藤 勝也; 鳴海 一成*

no journal, , 

化学合成農薬は数多くの課題を抱えていることから、天敵を利用する生物的防除法の開発が注目されている。害虫の生物的防除法の基幹技術のひとつとして昆虫病原糸状菌があるが、高温下において感染しにくいという難題を抱えている。本研究の目的は、炭素イオンビームあるいは$$gamma$$線の照射による突然変異育種技術を用いて、昆虫病原糸状菌(${it Metarhizium anisopliae}$)の高温耐性を強化することである。得られた高温耐性変異体については、植物病原糸状菌などにおいて高温耐性との関連が示唆されている遺伝子の変異を解析した。

口頭

重イオンビームによるエタノール発酵用酵母の育種と探索

荻野 千秋*; 山田 良祐*; 近藤 昭彦*; 佐藤 勝也; 大野 豊

no journal, , 

近年の石油資源の枯渇問題に端を発し、バイオマスを原料とするバイオエタノールの生産が大きく注目されている。バイオエタノール生産には、バイオマスの前処理、酵素糖化、微生物によるエタノール発酵の3つの工程が必要である。バイオマスの前処理および酵素糖化の工程では、複数の化学物質がバイオマス中より遊離することが明らかとなっており、これらの物質が微生物発酵に阻害を及ぼしていることが明らかとなっている。したがって、これらの化学物質に対して耐性を有する酵母菌株の探索は、効率の高いエタノール醗酵を目指すには重要である。多くの研究者が紫外線照射や発がん性物質の添加誘導による遺伝子変異を試みて、変異型酵母株の選抜を行ってきているが、劇的な変異酵母株の育種には成功していないのが現状である。本研究では、このような背景を踏まえて、カーボン重イオンビーム照射法を用いて、酵母株の選抜を試みた。

口頭

${it Vigna}$属野生植物の環境耐性型新作物の開発に向けた根粒菌のイオンビーム照射による改良

横山 正*; 丸山 雄大*; 武田 喜代子*; 友岡 憲彦*; 佐藤 勝也; 大野 豊

no journal, , 

沖縄県の南西諸島の海岸に分布しているハマアズキ(${it Vigna marina}$)が、陸生植物の中でも高い耐塩性(400mM NaCl耐性)を持つこと、また、その根粒には3.5% NaClという高ストレス条件下でも生存可能な${it Sinorhizobium}$属根粒菌が共生していることを見出した。しかし、${it Sinorhizobium}$属根粒菌を塩存在下で接種すると、根粒を形成する最大NaCl濃度は80mMであり、その環境で窒素固定能は非常に低下していた。ハマアズキと${it Sinorhizobium}$属根粒菌は、それぞれが優れた耐塩性を有しているが、共生は遥かに低い塩濃度でないと成立しないことが分かってきた。そこで、本研究では、イオンビーム誘発突然変異育種技術を利用した${it Sinorhizobium}$属根粒菌の共生特性の改良により、ハマアズキと${it Sinorhizobium}$属根粒菌の共生限界のNaCl濃度を高めることが可能か検討した。

口頭

変異体ライブラリーからの高エタノール発酵性酵母のスクリーニング

荻野 千秋*; Kahar, P.*; Lee, J. M.*; 近藤 昭彦*; 佐藤 勝也; 大野 豊

no journal, , 

近年の石油資源の枯渇問題に端を発し、バイオマスを原料とするバイオエタノールの生産が大きく注目されている。バイオエタノール生産には、バイオマスの前処理、酵素糖化、微生物によるエタノール発酵の3つの工程が必要である。バイオマスの前処理および酵素糖化の工程では、複数の化学物質がバイオマス中より遊離することが明らかとなっており、これらの物質が微生物発酵に阻害を及ぼしていることが明らかとなっている。したがって、これらの化学物質に対して耐性を有する酵母菌株の探索は、効率の高いエタノール醗酵を目指すには重要である。そこで、本研究では、イオンビーム育種技術により、化学物質に対して耐性を有する酵母菌株の探索を試みた。その結果、温度耐性が向上した変異導入株の取得に成功した。さらに、この変異導入株では高い繰返しエタノール発酵性も確認できた。

口頭

清酒酵母の遺伝子機能解析による新規酵母選別法の開発,3

増渕 隆*; 渡口 和樹*; 池永 裕*; 林 秀謙*; 佐藤 勝也; 大野 豊

no journal, , 

群馬県では、オリジナルの吟醸用清酒酵母を開発するために、$$^{12}$$C$$^{5+}$$(220MeV)のイオンビーム照射による突然変異で新たな吟醸用清酒酵母の開発を行っており、これまでに吟醸酒特有の香気成分であるカプロン酸エチルを高生産する優良清酒酵母(No.227)を選抜した。しかしカプロン酸エチル高生産酵母は発酵能が弱くなることがあり、また、変異株の選抜・機能評価は多大な手数と時間を必要とし、研究の遂行を困難にする一因となっている。本研究はNo.227とその親株である清酒酵母きょうかい901号(ky901)の全ゲノムDNA塩基配列を解読し、比較ゲノム解析することで、酵母選抜のメルクマールとなる香気生成能・発酵能に関与する遺伝子群を特定すること目的として行った。その結果、No.227において、ky901と異なる表現形質であるカプロン酸エチル高生産性、アルコール発酵能の低下への関与が示唆される遺伝子群を推定することができた。しかし、得られたゲノムDNA情報はまだギャップを多く含んでおり、さらにゲノム解析を進め、これら遺伝子群への突然変異を確認する必要があると考えられる。

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