A Novel methodology for characterizing strand-break termini and damaged bases in plasmid DNA exposed to ionizing radiations

電離放射線によって生じたプラスミドDNA中の鎖切断末端及び塩基損傷の形態解明のための新しい方法体系

赤松 憲; 和田 成一*; 小林 泰彦

Akamatsu, Ken; Wada, Seiichi*; Kobayashi, Yasuhiko

DNA損傷の形態に関する情報は、その修復過程を明らかにするうえで重要である。特に、放射線によって誘起される損傷はその化学構造のみでなくその3次元的な分布が多種多様であると予想され、そのことが放射線影響の基礎過程解明を困難にしている。そこでわれわれは、酵素の基質特異性を利用して、直接効果によって生じる鎖切断末端の定性・定量を試みた。線源としては、Heイオンビーム(200keV/m)、及び標準線源としてCo-60線を用いた。DNAにはpUC19プラスミドDNA, DNA加水分解酵素としては、3'水酸基末端から逐次2'-deoxynucleotide-5-phosphate(pdN)を切り出す酵素(SVPD), 鎖切断端の遊離リン酸基を脱離させる酵素(CIAP)を用いた。照射はDNA薄膜に対して真空中で行った。照射後にCIAP処理を行ったDNAと、行わないDNAそれぞれに対してSVPDを所定時間作用させ、切り出されるpdNをHPLCで分析・定量した。データ解析の結果、線とHeイオンビームでは鎖切断末端の構造に違いがないことがわかった。しかしながらHeイオンビームでは線の場合よりも塩基損傷が生じやすいことが明らかとなった。

We have developed new methodology to characterize radiation damage in DNA. An enzyme system consisting of the 3' to 5'exonuclease snake venom phosphodiesterase (SVPD) and calf intestine alkaline phosphatase (CIAP) was used to examine the 3'termini of strand break sites. In this study, we hypothesized that the strand-break termini can be divided into two categories:CIAP-independent SVPD sites and CIAP-dependent SVPD sites. The former consists of strand-break termini that can directly be recognized and digested by SVPD without CIAP pretreatment, whereas the latter includes the termini that cannot be digested by SVPD without CIAP pretreatment. As the results, the G-value for total strand breaks in fully dried DNA irradiated with Co-rays was estimated to be 0.1 micromol/J. Moreover, the G-values of CIAP-dependent and CIAP-independent SVPD sites were estimated to be 0.078 and 0.024 micromol/J, respectively.