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加道 雅孝; 岸本 牧; 保 智己*; 安田 恵子*; 青山 雅人*; 刀祢 重信*; 篠原 邦夫*
AIP Conference Proceedings 1696, p.020019_1 - 020019_4, 2016/01
被引用回数：4 パーセンタイル：90.17(Microscopy)軟X線顕微鏡は生きている細胞の細胞内小器官を観察するための非常に強力なツールであり、これまで細胞の内部構造を観察するための多くの研究開発が行われてきた。しかし、細胞内構造は非常に複雑で、軟X線顕微鏡で取得した細胞の軟X線顕微鏡像において細胞内小器官を特定することは困難であった。我々は、同一細胞を軟X線顕微鏡と蛍光顕微鏡により同時に観察するハイブリッドイメージング法を提案した。細胞にあらかじめ蛍光標識を施すことにより蛍光顕微鏡により細胞内小器官の位置を正確に特定することができ、蛍光顕微鏡によって得られた細胞内小器官の位置情報を用いて軟X線顕微鏡で取得した細胞の軟X線顕微鏡像において細胞内構造を正確に特定可能となる。軟X線顕微鏡は蛍光顕微鏡よりはるかに高い空間分解能を持つため、正確に特定された細胞内小器官の詳細な構造の解析が可能である。ハイブリッドイメージング法により生きている細胞の観察を行った。その結果、生きている細胞内のミトコンドリアの詳細な構造が確認できた。
小池 雅人
平成9年度-平成12年度科学研究費補助金,研究成果報告書(研究課題番号09309001), p.70 - 76, 2001/03
東京大学高輝度光源(VSX)利用計画では軟X線顕微鏡ビームラインの一つとして投影型顕微鏡が検討されているが、ビームラインとしては挿入光源(アンジュレータ)の空間及び時間コヒーレンスを最大限に利用するように設計することが重要である。ビームライン構成としては時間コヒーレンスの確保のための分光器、空間コヒーレンス確保のためのピンホール,ゾーンプレート,アパーチャーなどである。軟X線顕微鏡の場合ゾーンプレートの縞数に対応した約1000以上,同分光顕微鏡の場合できる限り高い波長分光能が要求される。また波長領域としては50eV~1.5keVをカバーできることが望ましいとされている。ここではVSX光源の27m長尺アンジュレータを想定して、不等間隔溝平面回折格子を用いたMond-Gillieson型分光器を用いた軟X線分光顕微鏡用コヒーレントビームラインの光学設計について検討した内容について報告する。
加道 雅孝; 岸本 牧; 刀祢 重信*; 保 智己*; 安田 恵子*; 青山 雅人*; 篠原 邦夫*
no journal, ,
水の窓波長域の軟X線を光源とした軟X線顕微鏡は水溶液中の生きている細胞を高い空間分解能で観察できる画期的な技術として開発が進められている。しかし、細胞周辺の水の層の厚さが10
mを超えると水による軟X線の吸収が無視できなくなるとともに、水の層の厚さが不均一な状況では高品質な軟X線像の取得ができないという問題が生じた。我々は、細胞の保持に使用する窒化シリコン窓の内側に高さ5mのスペーサーと適切な溝パターンを構築することにより、PMMAフォトレジストと窒化シリコン窓の間に厚さ5mのスペースを確保するとともに、余分な水分を外部に排出することにより試料周辺の水の層の厚さを正確に制御することに成功した。その結果、非常に高解像度な細胞の軟X線像の取得に成功した。
加道 雅孝; 岸本 牧; 江島 丈雄*; 保 智己*; 安田 恵子*; 青山 雅人*; 篠原 邦夫*
no journal, ,
軟X線顕微鏡による細胞の観察では放射線による損傷を抑制するために試料の凍結が必要で、生きている細胞をそのまま観察することはできなかった。レーザー生成プラズマ軟X線源は高輝度で短パルスという特徴を持つため、放射線による損傷が生じる前に細胞の軟X線像を取得することが可能である。一方、軟X線顕微鏡の空間分解能は細胞に照射されるX線光量に強く依存するため、細胞の内部構造を観察するためには軟X線源の高輝度化が重要な課題となる。我々は、大阪大学レーザーエネルギー学研究センターの保有する出力120Jの大型レーザーを用いることにより軟X線源の大幅な高輝度化を実現した。X線感光材上に培養した含水細胞の観察を行った結果、空間分解能の向上により細胞周辺にこれまで同様の実験では確認されなかった極微細な繊毛らしき構造の観察に成功した。
加道 雅孝; 岸本 牧; 保 智己*; 安田 恵子*; 青山 雅人*; 篠原 邦夫*
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高強度レーザーによって発生した高輝度短パルス軟X線源とX線感光材上に直接培養した細胞に軟X線を照射する密着型顕微法を組み合わせたレーザープラズマ軟X線顕微鏡を開発し、生きている細胞の内部構造を直接観察することに成功した。さらに蛍光顕微鏡を併用し、軟X線顕微鏡と蛍光顕微鏡により同一の細胞の同時観察を実現するハイブリッド顕微法を発案することにより細胞内器官の正確な位置の特定と高空間分解観察を両立した。その結果、様々な細胞内器官の詳細な構造の観察が可能となった。開発したレーザープラズマ軟X線顕微鏡によりこれまでにマウスの精巣ライディッヒ細胞の内部構造の観察やアポトーシスの誘発により構造変化を起こしたHeLa S3細胞核の詳細な構造の観察を実現した。マウスの免疫細胞の観察では免疫機能発現の瞬間の重要な構造変化を観察することに成功するなど、従来の顕微鏡では限界のあった生きている細胞を軟X線顕微鏡で観察することにより、幾つかの重要な知見を得ることに成功した。
加道 雅孝; 岸本 牧; 保 智己*; 安田 恵子*; 青山 雅人*; 刀祢 重信*; 篠原 邦夫*
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酸素と炭素のK吸収端で挟まれた波長領域(2.3nm
4.4nm)は"水の窓"波長と呼ばれ、細胞の主要構成要素である炭素による吸収が大きいが、水にはほとんど吸収されないという特徴を持つ。水の窓波長の軟X線を照明光として用いた顕微鏡(軟X線顕微鏡)は生きている細胞を無染色でそのまま観察可能であるという特徴を持ち、さらに可視光に比べて波長がはるかに短いため、細胞内部構造の詳細な観察が可能である。さらに、高輝度で短パルスという特徴を持つレーザープラズマ軟X線源を光源に用いたレーザープラズマ軟X線顕微鏡は、放射線による細胞への影響や細胞内構造の揺らぎによる空間分解能の低下を抑え、生きている細胞のその場観察が可能である。我々は、波長1053nm、出力20J、パルス幅600psの高出力ガラスレーザーを金の薄膜ターゲットに集光し、水の窓波長軟X線を発生した。細胞をPMMAフォトレジスト上に直接培養することにより、レーザープラズマ軟X線顕微鏡による生きている細胞のその場観察を実現した。
加道 雅孝
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レーザープラズマを光源とした軟X線顕微鏡は生きている細胞の内部構造を100nm以下の解像度で観察できるという特徴を持ち、様々な生命現象を理解する上で非常に強力な観察手法を提供する。講演では、レーザープラズマ軟X線顕微鏡の開発と細胞の観察の具体例について報告を行うとともに、重要な生命現象の一つである細胞死の観察結果についても報告を行う。
加道 雅孝; 岸本 牧; 石野 雅彦; 保 智己*; 安田 恵子*; 青山 雅人*; 刀祢 重信*; 篠原 邦夫*
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高輝度短パルス軟X線源と密着型軟X線顕微法を組み合わせたレーザープラズマ軟X線顕微鏡を開発し、X線感光材上に細胞を直接培養することにより、生きている細胞の内部構造をその場観察することに成功した。さらに、開発したレーザープラズマ軟X線顕微鏡と蛍光顕微鏡を併用し、同一の細胞を観察する相関顕微法を考案し、マウスの精巣ライディッヒ細胞の詳細な内部構造、アポトーシスを起こした細胞核の詳細な構造変化やマウスの免疫細胞の観察に成功した。免疫細胞の観察では、免疫機能発現の際に、細胞表面に触手様の構造が現れることを初めて確認した。
加道 雅孝
no journal, ,
酸素と炭素のK吸収端で挟まれた波長領域(2.3nm4.4nm)は"水の窓"波長と呼ばれ、細胞の主要構成要素である炭素による吸収が大きいが、構成要素の70%程度を占める水にはほとんど吸収されないという特徴を持つ。水の窓波長の軟X線を照明光として用いた顕微鏡(軟X線顕微鏡)は生きている細胞を無染色でそのまま観察可能であるという特徴を持ち、さらに可視光に比べて波長がはるかに短いため、細胞内部構造の詳細な観察が可能である。さらに、高輝度で短パルスという特徴を持つレーザープラズマ軟X線源を光源に用いたレーザープラズマ軟X線顕微鏡は、放射線による細胞への影響や細胞内構造の揺らぎによる空間分解能の低下を抑え、生きている細胞のその場観察が可能である。我々は、同一細胞を軟X線顕微鏡と蛍光顕微鏡によりほぼ同時に観察する技術を開発し、培養中の細胞のその場観察によりミトコンドリアや細胞骨格等の細胞内小器官の詳細な観察に成功した。
加道 雅孝; 岸本 牧; 保 智己*; 安田 恵子*; 青山 雅人*; 刀祢 重信*; 篠原 邦夫*
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高輝度で短パルスという特徴を持つレーザー生成プラズマを光源とした軟X線顕微鏡(レーザープラズマ軟X線顕微鏡)は細胞を生きたまま瞬時に高い空間分解能で撮像することが可能である。開発したレーザープラズマ軟X線顕微鏡により生きている細胞を観察した結果、細胞内の様々な小器官を詳細に観察することに成功した。さらに、アポトーシスを誘発した細胞核の構造変化の観察にも成功した。
加道 雅孝; 岸本 牧; 江島 丈雄*; 保 智己*; 安田 恵子*; 青山 雅人*; 刀祢 重信*; 篠原 邦夫*
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軟X線顕微鏡の空間分解能は細胞に照射されるX線光量に強く依存するため、高い空間分解能を実現するためにはより高輝度な軟X線源が必要となる。これまで原子力機構関西研の保有する出力20Jの高強度レーザーを利用したレーザープラズマ軟X線顕微鏡の開発を行い、生きている細胞内のミトコンドリア等の詳細な構造の観察に成功した。さらなる高空間分解能の実現を目指し、大阪大学レーザーエネルギー学研究センターの保有する出力120Jの大型レーザーを用いて実験を行った。レーザー波長の短波長化によるX線への変換効率の向上も考慮すると10倍以上のX線光量の増大が期待できる。X線感光材上に培養した含水細胞の観察を行った結果、空間分解能の向上により細胞周辺にこれまで同様の実験では確認されなかった極微細な繊毛らしき構造の観察に成功した。
加道 雅孝; 石野 雅彦; 岸本 牧; 保 智己*; 安田 恵子*; 篠原 邦夫*
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高輝度X線は生きている生物試料を観察するためのX線顕微鏡の光源として非常に有用である。特に、水の窓と呼ばれる波長2.3nm-4.4nmの領域においてX線光量を向上することはX線顕微鏡用の光源として利用するために重要な課題である。我々は、ターゲットによって吸収されたレーザーのエネルギーがターゲット内部に拡散することによるエネルギーの損失を抑え、効率的にターゲットを加熱できる極薄膜ターゲットを考案した。厚さ10nm-50mの様々な厚さの金薄膜ターゲットを波長1.053m、パルス幅600ps、出力20JのNd:glassレーザーによって照射し、発生した軟X線を軟X線分光器と軟X線プラズマカメラにより計測した。その結果、ターゲットの厚さが薄くなるほどX線強度が増加し、ターゲットの厚さが20nmの時に最大の強度が得られることがわかった。金の極薄膜ターゲットから発生した軟X線を用いて生きている細胞の観察を行った結果、細胞内の詳細な構造の観察に成功した。
加道 雅孝; 岸本 牧; 保 智己*; 安田 恵子*; 青山 雅人*; 篠原 邦夫*
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密着型軟X線顕微鏡と高輝度レーザープラズマ軟X線源を組み合わせ、生きている細胞の瞬時撮像を実現した。高強度レーザーにより生成したレーザープラズマ軟X線源は非常に高輝度で短パルスという特徴を持ち、生きている細胞を瞬時に撮像することにより放射線による細胞への損傷を抑制することが可能である。我々は、蛍光顕微鏡を併用することにより軟X線顕微鏡によって撮像した細胞内器官を正確に特定する手法の開発にも成功した。この手法により、X線感光材上に直接培養した細胞を軟X線顕微鏡と蛍光顕微鏡により同時に撮像でき、取得した細胞の軟X線像と蛍光像を直接比較することによりミトコンドリアやアクチンフィラメント、クロマチンなどの細胞内器官を明確に特定可能である。軟X線顕微鏡は蛍光顕微鏡に比べて高い解像度を有する一方、撮像した細胞内構造の特定が困難であるという問題があったが、この手法の開発により、これまで不可能であった生きている細胞内の正確に特定された細胞内器官の構造をより詳細に観察可能となった。
加道 雅孝; 岸本 牧; 保 智己*; 安田 恵子*; 青山 雅人*; 刀祢 重信*; 篠原 邦夫*
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高輝度レーザープラズマ軟X線源と密着型顕微法を組み合わせたレーザープラズマ軟X線顕微鏡を開発した。レーザープラズマ軟X線顕微鏡は、生きている細胞を1ナノ秒以下の短時間で瞬時に撮像することにより、生きている状態で撮像することを可能とする。我々は、生きている細胞の内部構造を高い空間分解能で観察できるレーザープラズマ軟X線顕微鏡と蛍光標識を用いることにより任意の細胞内小器官を選択的に可視化できる蛍光顕微鏡により同一の細胞を同時に観察する相関顕微法を考案した。相関顕微法により、生きている細胞とその様々な細胞内小器官を観察し、蛍光顕微鏡によって得られた細胞内小器官の位置情報を用いて軟X線顕微鏡で得られた細胞内構造を正確に特定した。蛍光顕微鏡よりも高い空間分解能を持つ軟X線顕微鏡の利点を生かすことにより、生きている細胞の細胞内小器官の詳細な構造を観察する顕微法を実現した。
加道 雅孝; 岸本 牧; 刀祢 重信*; 保 智己*; 安田 恵子*; 青山 雅人*; 篠原 邦夫*
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高輝度レーザープラズマ軟X線源を光源とした軟X線顕微鏡(レーザープラズマ軟X線顕微鏡)は生きている生物試料を100nm以下の空間分解能で瞬時に撮像することができる。これまで、レーザープラズマ軟X線顕微鏡を用いてマウスの精巣ライディッヒ細胞の細胞内小器官の構造や免疫細胞の機能発現に伴う構造変化など、様々な細胞の内部構造を生きたまま観察することに成功してきた。我々は、開発したレーザープラズマ軟X線顕微鏡を重要な生命現象の一つであるアポトーシスを起こした細胞核の構造変化の観察に応用した。その結果、細胞核の構造変化の過程で、リング状の構造に亀裂が入り、ネックレス状に変化している様子が詳細に確認できた。また、これまでの研究では細胞核内部は論及されてこなかったが、軟X線顕微鏡による観察では内部に構造を確認できた。
加道 雅孝; 岸本 牧; 保 智己*; 安田 恵子*; 青山 雅人*; 刀祢 重信*; 篠原 邦夫*
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高輝度レーザーで生成したレーザープラズマを光源とした軟X線顕微鏡(レーザープラズマ軟X線顕微鏡)は、生理活性状態にある細胞を生きたまま瞬時に観察可能で、様々な生命現象の観察が期待されている。しかし、細胞内には多くの細胞内小器官が密に分布しており、非常に複雑な構造となっている。そのため、レーザープラズマ軟X線顕微鏡で撮像した細胞内の構造をそれぞれ特定の細胞内小器官と対応付けることが困難であった。我々は、細胞内小器官に選択的に蛍光標識を施すことに特定の細胞内小器官を可視化できる蛍光顕微鏡と生きている細胞内の小器官を高い空間分解能で観察できるレーザープラズマ軟X線顕微鏡を組み合わせた相関顕微法を提案し、生きている細胞内のミトコンドリアの詳細な構造を観察することに成功した。
