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神長 輝一; 野口 実穂; 成田 あゆみ; 坂本 由佳; 嘉成 由紀子; 横谷 明徳
Radiation Protection Dosimetry, 166(1-4), p.91 - 94, 2015/09
被引用回数：5 パーセンタイル：46.24(Environmental Sciences)To explore radiation effects on the mammalian cell cycle, it would be essential to trace single cells as live cell images observed by a time-lapse imaging technique. HeLa-FUCCI cells are one of useful model cell lines to visualize cell cycle because their nucleus show different colors. We irradiated the cells with X-rays of 5 Gy. The cells were incubated for 48 hr in a small incubator set on a fluorescent microscope to track about 40 cells. Most of the irradiated cells underwent cell division at M phase, and then progressed into G1 phase. However, about a half of the cell population showed a significantly longer period toward cell division, indicating that G2 phase was prolonged (G2 arrest) by irradiation. The elongation of G2 phase was more prominent for irradiation to cells in S/G2 phase than those in G1 phase. The observed cell cycle modification suggests that G2/M checkpoint system control the cycle to ensure repairing DNA damage.
成田 あゆみ; 神長 輝一; 横谷 明徳; 野口 実穂; 小林 克己*; 宇佐美 徳子*; 藤井 健太郎
Radiation Protection Dosimetry, 166(1-4), p.192 - 196, 2015/09
被引用回数：2 パーセンタイル：74.39(Environmental Sciences)動物培養細胞の細胞周期に依存した放射線照射影響に関する知見は、そのほとんどが照射された細胞集団を統計学的手法により解析したものである。本研究は、照射された細胞一つを顕微鏡下で直接追跡することにより、刻々と変化する照射細胞の挙動をリアルタイムで観察する手法を確立することを目的とした。照射細胞には細胞周期が判別できるFUCCI(Fluorescent Ubiquitination-based Cell CycleIndicator)発現HeLa細胞(ヒトがん細胞)を用いた。また、照射には細胞一つ分まで大きさが調整できる放射光X線マイクロビームを利用した。さらに照射した細胞を長時間観察するために、細胞を培養しながら観察可能なタイムラプス顕微鏡を立ち上げ、照射した個々の細胞の分裂の様子を追跡した。その結果、G1期で照射した細胞では周期の遅延が認められなかった。それに対してS/G2期にある細胞に照射を行ったところ、明確な周期遅延が観察された。以上から、顕微鏡下での長時間観察によって、放射線照射された細胞への影響をリアルタイムで観察することができた。
横谷 明徳; 神長 輝一
放射線生物研究, 49(4), p.418 - 431, 2014/12
最近、細胞標識技術の発展に伴う顕微鏡下でのライブセルイメージングにより、細胞の様々な活動が比較的容易に動画像(ムービー)として観察できるようになった。これらの実験により得られた動画像データは、個々の細胞に関する豊富な情報を含む。このような細胞機能に関するダイナミクスは、従来の免疫染色による静止画像データや細胞集団全体から生化学的に抽出された生体分子の平均化された値からは得ることができない。われわれは、細胞周期がライブセルでモニターできるHeLa-Fucci細胞を試料とし、タイムラプス法を用いてX線照射後に個々の細胞の細胞周期を追跡した。その結果、細胞集団は細胞周期が変調する群とほとんど影響を受けない群の2つに分かれる可能性が示された。このデータに対してシステム生物学的な解釈を試み、HeLa細胞の細胞周期制御とG2/Mチェックポイントのシグナル伝達系に内在する、"デジタル"的なスイッチ機構の存在を推定した。
嘉成 由紀子; 野口 実穂; 神長 輝一; 坂本 由佳; 横谷 明徳
Journal of Radiation Research, 55(Suppl.1), p.i129 - i130, 2014/03
In this study, we report a new approach of tracing the mitochondrial morphological change of the cells exposed to high LET radiation using a live-cell imaging technique. We used the NMuMG (Normal murine mammary gland)-FUCCI2 cell line. Using the FUCCI2 expressing cells, we can observe red fluorescence in the nuclei of G1 phase cells and green fluorescence in the nuclei of S/G2/M phase cells. We labeled mitochondria by Mitotracker Red. Kinetics of mitochondrial morphology was analyzed by the live-cell imaging technique using a fluorescence microscope. Mitochondrial images were captured for 4 days after irradiation. In a preliminary study, we found that X-ray irradiation of cells caused mitochondrial fragmentation, and proportion of cell population with fragmented mitochondria increased with increasing dose and with time after irradiation. It is demonstrated that the method proposed in this study works successively to trace cytoplasmic effects by high LET irradiation.
神長 輝一; 坂本 由佳; 嘉成 由紀子; 野口 実穂; 横谷 明徳
Journal of Radiation Research, 55(Suppl.1), p.i127 - i128, 2014/03
Fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator (FUCCI) HeLa cells are one of useful model cell lines to visualize a cell-cycle because their nuclei show different colors; orange indicating G1; green indicating S/G2. In order to establish a novel assay system to study cell-cycle modification by high LET irradiation such as ion beams for cancer therapy we have observed time-lapse images of HeLa-FUCCI cells irradiated as a preliminary experiment using conventional X-rays instead of high LET ion beams. The cell-cycle was strongly arrested by irradiation at S/G2 and never progressed to G1. In contrast, cells irradiated at G1 progress to S/G2 with a similar time course as non-irradiated control cells. These results show that single FUCCI cell exposure and live cell imaging are a powerful method to trace the single cell effect of high LET irradiation on the cell-cycle in future.
坂本 由佳; 神長 輝一; 嘉成 由紀子; 野口 実穂; 横谷 明徳
Journal of Radiation Research, 55(Suppl.1), p.i120 - i121, 2014/03
In order to examine bystander effects in the 3D cell system, we have developed a FUCCI-HeLa spheroid system. FUCCI (Fluorescent Ubiquitination-based Cell Cycle Indicator) cells show specific colors of cell nuclei depending on a cell cycle. Thus we can easily trace cell cycle modifications by irradiation. We observed bystander cell-cycle delay as preliminary tests using monolayer culture of the HeLa-FUCCI cells. It will be very interesting to examine whether the cell-cycle effect also appears in the 3D cell system exposed to single high LET particles. We have determined suitable conditions for the spheroid culture, such as size of spheroids and methods of stable fixing a spheroid in a dish to perform the microbeam irradiation, and observation of the cell cycles of each cell in a spheroid after irradiation using a time-lapse micro-imaging technique.
横谷 明徳; 野口 実穂; 神長 輝一; 坂本 由佳; 嘉成 由紀子; 成田 あゆみ; 藤井 健太郎
no journal, ,
本研究では、Fucci(Fluorescent Ubiquitination-based Cell Cycle Indicator)発現したHeLa細胞に対してX線を照射し、細胞周期への照射の影響を観察した。Fucci発現細胞ではG1あるいはS/G2/M期にある細胞核中にそれぞれ異なる色の蛍光が観測されることから、顕微鏡下で容易に区別できる。培養ディッシュに播種した細胞に、X線照射を行った。照射後細胞ディッシュを蛍光顕微鏡に設置された細胞培養ステージに移し、24
48時間15分程度の間隔で画像撮影を行った。得られた画像は、顕微画像タイムラプス解析ソフトで動画像として時系列再構築を行った。20Gyの照射により次第に緑色の細胞が増加し、10時間程度でほとんどが緑色の細胞になった。また、ディッシュの半分だけ照射した場合でも、非照射部位の細胞のほとんどが緑色になった。これらの結果は、照射により細胞周期がG2で顕著に休止し、通常8時間程度続くG2期間がほぼ倍になることをしめしている。さらにこの細胞周期遅延効果が非照射部位にも及ぶことから、新しいバイスタンダー効果がある可能性を見いだした。
野口 実穂; 嘉成 由紀子; 神長 輝一; 坂本 由佳; 成田 あゆみ; 藤井 健太郎; 横谷 明徳
no journal, ,
放射線による細胞影響は核DNAへの損傷を起点として多くの研究が行われているが、低線量放射線被ばくなど細胞質のみがヒットを受けた場合の細胞影響を明らかにすることも必要不可欠である。ミトコンドリアは細胞質に広範囲に存在する細胞小器官であり、独自の遺伝子を持ち、エネルギー産生、細胞死の調節など細胞の重要な機能を担う。そこで、本研究では細胞質の中でも特にミトコンドリアに注目し、ミトコンドリアに対する放射線の影響を明らかにすることを目的とした。本研究では、ミトコンドリアをMitotracker Red、核をHoechst33342で染色し、X線照射後4日間経時的にミトコンドリアの形態変化を観察した。また細胞周期はNMuMG-Fucci2細胞を用い、核の色素変化によりその周期を同定した。その結果、ミトコンドリアは線量の増加ともに細かく断片化され、断片化ミトコンドリアを持つ細胞数は照射後3日目がピークになり、その後は減少することが明らかになった。また、8Gy照射により8割以上の細胞はG1期で細胞周期を停止することも明らかになった。本発表では放射線照射後のミトコンドリアの形態変化と細胞周期変化との関係性について報告する。
野口 実穂; 嘉成 由紀子; 神長 輝一; 坂本 由佳; 成田 あゆみ; 藤井 健太郎; 横谷 明徳
no journal, ,
Recent reports suggest that extranuclear targets in cytoplasm may have a role in mediating radiation effects on mammalian cells exposed to ionizing radiation. Mitochondria, a kind of major organelles, are distributed throughout cytoplasm. They contain their own genome, and mediate essential cell functions, such as generation of ATP and regulation of cell death. Radiation effect on mitochondrial functions, however, remains to be fully elucidated. As the first step to understand the cytoplasmic effects of radiation, we have examined mitochondrial morphology in mammalian cells exposed to X-rays. Mitochondria are continuously fusing or dividing during mitosis, or in response to environmental condition changes. In this study, after irradiation of X-rays to mouse cells, we labeled mitochondria by Mitotracker Red and analyzed kinetics of mitochondrial morphology by a live-cell imaging technique using a fluorescence microscope. We demonstrated that X-irradiation causes mitochondrial fragmentation and the frequency of fragmentation increases with increasing X-ray dose. We report the radiation induced mitochondrial morphological change.
成田 あゆみ; 神長 輝一; 野口 実穂; 横谷 明徳; 小林 克己*; 宇佐美 徳子*; 藤井 健太郎
no journal, ,
細胞周期に依存した放射線照射影響を観察及び解析するためには、任意の細胞周期にある細胞を選択し、その細胞のみを狙い撃ちすることが必要である。この課題を解決するために、われわれは顕微鏡下で観察するだけで細胞周期が判別できるFUCCI(Fluorescent Ubiquitination-based Cell Cycle Indicator)発現HeLa細胞(ヒトがん細胞)と、細胞一つ分まで大きさが調整できる放射光X線マイクロビームに着目した。さらに照射した細胞を長時間観察するために、細胞を培養しながら観察可能なタイムラプス顕微鏡を立ち上げ、照射した個々の細胞の分裂の様子を追跡した。その結果、G1期で照射した細胞では周期の遅延が認められなかった。それに対してS/G2期にある細胞に照射を行ったところ、明確な周期遅延が観察された。以上から、顕微鏡下での長時間観察によって、放射線照射された細胞への影響をリアルタイムで観察することができた。
神長 輝一; 成田 あゆみ; 野口 実穂; 小林 克己*; 宇佐美 徳子*; 横谷 明徳
no journal, ,
本研究では、放射線の細胞周期への影響を明らかにすることを目指し、X線照射した個々の細胞に対する長時間の経時間観察を行った。対数増殖期にある細胞に放射線を照射すると細胞周期の遅延が観察される。これは、細胞が照射により生じたDNA損傷を修復するための時間を確保するために、チェックポイント機構が働いて細胞周期を一定時間停止させているためであると言われている。本研究では、細胞試料としてFucci化したヒトガン細胞(HeLa)を用いた。Fucci細胞は蛍光顕微鏡下で細胞周期特異的に2色の蛍光(G1期には赤色をG1期以外のS, G2, M期には緑色)を発するため、細胞周期観察には最適な細胞である。照射後の細胞に対して、任意の時間間隔で長時間撮影した(タイムラプスイメージング)。撮影された画像を元に各細胞の周期の長さを測定しところ、5GyのX線を照射したときの細胞周期遅延時間は3.3時間であることがわかった。細胞周期の遅延が観察されたのは、緑色の発現時間が伸びていることから、S, G2あるいはM期のいずれかにおけるチェックポイント機構が働いたためであると考えられる。
坂本 由佳; 嘉成 由紀子; 神長 輝一; 野口 実穂; 横谷 明徳
no journal, ,
細胞に対する低線量放射線による影響を長期にわたって観察するために、福島県から採取してきた土壌を利用した細胞培養装置を立ち上げた。この装置内での線量率は約17
Sv/hであり、現在の飯館村における高線量地区(約5Sv/h)の4倍弱である。この培養装置を用いて30日間にわたりヒトガン細胞(HeLa)の単層培養を行った。30日間の積算線量は13mSvであった。培養した細胞に対して、成長曲線の観測及び急性X線照射による生存率の測定を行った。その結果、成長曲線と生存率の双方において、低線量率照射を行っていない対照群とは明確な差がないことが明らかになった。さらに本研究では、単層培養細胞より生体組織に近い、3次元培養組織(スフェロイド)の作成を試みた。HeLa細胞を試料として用い、さまざまな培養条件を検討した。その結果、低付着性細胞培養器材(24穴)を用い、ひとつの穴(ウェル)あたり1.0
10
以上の細胞数を播種し、これを4日間培養することが最適条件であることを見いだした。今後この条件で作成したスフェロイドに対して、低線量照射実験を行う予定である。
神長 輝一; 成田 あゆみ; 野口 実穂; 嘉成 由紀子; 坂本 由佳; 横谷 明徳
no journal, ,
本研究では、放射線が照射された細胞の周期がどのような影響を受けるかを明らかにすることを目的とした。細胞周期特異的に核が蛍光を発するように設計されたFucci化したヒト細胞を照射試料として用いて、個々の細胞を追跡しながら観察を行った。観察には、小型インキュベーターを内蔵した蛍光顕微鏡を用いた。細胞にX線を照射したのち、48時間のタイムラプス観察を行った。得られた画像データから個々の細胞の細胞周期を特定しコントロール細胞の細胞周期と比較することでX線照射による細胞周期変化を分析した。X線を5Gy照射した場合に観察される細胞周期変化は、約3.3時間の遅延であった。さらに照射細胞周囲の非照射細胞への影響を調べるため、培養ディシュの半分にのみX線(20Gy)を照射したところ、非照射細胞にも明らかな細胞周期の遅延が観察された。これまでにも照射細胞から非照射細胞へ信号が伝達され、微小核形成などの影響が現れる所謂バイスタンダー効果が知られてきた。本研究により、細胞周期遅延誘発にもバイスタンダー効果があることが初めて示された。
神長 輝一; 成田 あゆみ; 野口 実穂; 横谷 明徳
no journal, ,
細胞に放射線が照射されると細胞周期がある個所で停止並びに遅延を起こす現象は以前から報告されてきた。しかし、これらの研究の多くはフローサイトメトリーなどの細胞集団を対象とした解析によるものだった。今回我々は、Fucci細胞を蛍光顕微鏡下で培養しながら個々の細胞を長時間経時観察することで細胞周期変化の解析を行った。その結果、比較的高い線量(5Gy)での細胞周期遅延時間は、約3時間程度であった。さらに、バイスタンダー効果により、非照射細胞にも周期変化が誘発されることも見出した。バイスタンダー効果による細胞周期への影響はこれまで研究例がなく、本研究が初めてである。今後は、バイスタンダー効果の伝達経路として考えられているギャップジャンクション並びに、培地中に放出されるバイスタンダー因子のキレート剤を用いてそれぞれの経路を遮断することで、各経路の細胞周期変化への寄与を突き止める予定である。
神長 輝一; 成田 あゆみ; 野口 実穂; 横谷 明徳
no journal, ,
細胞に放射線が照射されると細胞周期がある個所では停止並びに遅延を起こす現象は以前から報告されてきた。しかし、これらの研究の多くはフローサイトメトリーなどの細胞集団を対象とした解析によるものだった。今回我々は、Fucci細胞を蛍光顕微鏡下で培養しながら個々の細胞を長時間経過観察することで細胞周期変化の解析を行った。その結果、比較的高い線量(5Gy)での細胞周期遅延時間は、約3時間程度であった。さらに、バイスタンダー効果により、非照射細胞にも周期変化が誘発されることも見出した。バイスタンダー効果による細胞周期への影響はこれまで研究例がなく、本研究が初めてである。今後は、バイスタンダー効果の伝達経路として考えられているギャップジャンクション並びに、培地中に放出されるバイスタンダー因子のキレート剤を用いてそれぞれの経路を遮断することで、各経路の細胞周期変化への寄与を突き止める予定である。
成田 あゆみ; 神長 輝一; 野口 実穂; 横谷 明徳; 小林 克己*; 宇佐美 徳子*; 藤井 健太郎
no journal, ,
細胞周期に依存した放射線照射影響を詳細に解析するために、これまでに我々はFUCCI(Fluorescent Ubiquitination-based Cell CycleIndicator)発現細胞、放射光X線マイクロビーム、そしてタイムラプス顕微システムを組み合わせた新規実験手法を確立してきた。その結果、照射した細胞周期によって現れる影響の違いをリアルタイムで観察することに成功した。本研究ではさらに詳細な照射影響を観察するために、照射後により長時間の経時観察を行うことで照射された個々の細胞の挙動を検証した。また照射された細胞だけでなく、照射細胞と同一視野内にある非照射細胞への影響も比較した。照射細胞に関してG1期で照射した場合には、照射後S期からG2期に進行するものの、そこからM期へは進行しなかった。G2期で照射すると60%の細胞がG1期に進行することなく細胞死した。一方で非照射細胞では、G1期から観察を始めた場合には照射細胞とほぼ同じ傾向を示した。それに対してG2期から観察を始めたときには細胞周期がM期からG1期に進行した。しかしながらG1期に進行したあとで細胞死する個体が照射細胞に比べて6倍になった。これは照射細胞から受けるバイスタンダー効果であると推測される。以上より、照射細胞だけでなく非照射細胞においても周期によって異なる現象が現れたことから、非照射細胞への影響も周期に依存性があることが明らかとなった。
嘉成 由紀子; 野口 実穂; 神長 輝一; 坂本 由佳; 横谷 明徳; 鈴木 啓司*
no journal, ,
低線量の放射線環境下では、細胞を通過する少数の放射線トラックは必ずしもDNAが存在する細胞核を貫通するとは限らない。むしろ細胞核以外の細胞質がヒットを受ける確率が高い。我々は細胞質中に広く存在するミトコンドリアに着目し、放射線照射によるミトコンドリアの形態や動態、膜電位の変化を明らかにすることを目的とした。KEK・PFのBL-27Bを利用し、専用のディッシュに培養したヒト繊維芽細胞(BJ1 hTERT Fucci)へ6Gy相当のX線マイクロビームを照射した後、ミトコンドリア動態のタイムラプス観察を行った。ミトコンドリアの膜電位変化は、膜電位依存性の蛍光試薬であるJC-1を用いて可視化した。タイムラプス動画像を元にして、ミトコンドリア活性部位(膜電位が高い部位)を追跡し、部位が位置を変える移動速度を数値化し動態変化として解析を行った。その結果、活性部位は照射後24時間から48時間にかけて空間位置を大きく変えるという、新しい現象を見出した。この位置変化の理由はまだ明らかではないが、放射線によるダメージからの回復に必要とされるATPを要求性の生理活性の上昇と関連があるのではないかと推測される。
神長 輝一; 成田 あゆみ; 野口 実穂; 嘉成 由紀子; 坂本 由佳; 横谷 明徳
no journal, ,
照射細胞からサイトカインなどの信号物質が放出され、周囲の照射細胞にも影響が伝搬するいわゆるバイスタンダー効果により、微小核形成などが誘発されることが知られている。本研究では、照射による細胞周期の遅延や停止といった現象も、このバイスタンダー効果により誘発され得るかを明らかにすることを目的としている。KEK・PFのBL27BのX線マイクロビームを利用し、狙った細胞にX線を照射した後の照射及び周囲の未照射の細胞の細胞周期の経時観察(タイムラプスイメージング)を試みた。細胞周期により細胞核の色が変化するFucci細胞を培養し数10個程度の細胞からなるマイクロコロニーを作成しこれを照射試料とした。その中の特定の細胞を狙い撃ちしたときの周囲の細胞の周期に注目し、タイムラプス観察を行った。その結果、周囲の細胞への明確な周期遅延効果は認められなかったものの、一部の照射した細胞自体の周期遅延が抑制される現象がみられた。これは周囲の細胞の存在により、照射細胞の応答が変わる「逆バイスタンダー効果」がある可能性を示している。
坂本 由佳; 嘉成 由紀子; 神長 輝一; 野口 実穂; 横谷 明徳
no journal, ,
低線量放射線による生物影響を考える上で、バイスタンダー効果は1つの重要なポイントであり、これまで様々な報告がされている。しかし、それらの研究のほとんどは単層培養の細胞を使用したものであり、細胞間の情報伝達物質も培地を介して移動することが分かっている。だが、実際の生体内は細胞同士が密になって組織を形成しており、その周囲に培地は存在していない。これらの矛盾を解決すべく、本研究ではスフェロイドに対するX線マイクロビーム照射といった新しい実験系を提案する。本研究ではヒトのガン細胞(HeLa-FUCCI)を培養し、直径100-200ミクロンのスフェロイドを作製した。このスフェロイドの中心に対し、KEK・PFにおいて20ミクロンのX線マイクロビームで部分照射を行った。しかし照射後にスフェロイドの経時観察を行おうとすると、その位置が顕微鏡の視野の外に出てしまうことが分かった。これは培養ディッシュの温度ムラや水蒸気の蒸発による対流が原因と考えられる。スフェロイドが一つだけ入るウェルのあるディッシュなど、さらに工夫が必要であることが分かった。
成田 あゆみ; 神長 輝一; 横谷 明徳; 野口 実穂; 小林 克己*; 宇佐美 徳子*; 藤井 健太郎
no journal, ,
ヒト由来の細胞に対して細胞周期に依存した照射影響を明らかにすることを目標とし、我々はこれまでにKEK-PF BL27Bにおいて、マイクロビームで狙い撃ちされた細胞をリアルタイム観察するための実験システムを構築してきた。本研究ではこのシステムを利用したより長時間の経時観察を行い、X線照射された細胞の行く末を追跡した。照射細胞には顕微鏡下で細胞周期が判別できるFUCCI(Fluorescent Ubiquitination-based Cell Cycle Indicator)発現HeLa細胞を用い、任意の周期にある細胞をマイクロビームで狙い撃ちした。その後、48時間の経時観察を行った。その結果、G2期で照射したときには、約60%の細胞がG2期からM期に進行する直前に細胞死に至った。これは損傷を修復するために周期が一時的に停止したものの、修復することができずにアポトーシスしたと考えられる。一方で同じ視野内にある非照射の細胞では、G2期から観察を開始したものに関しては、周期が進行してから細胞死したものの割合が増加した。これは照射細胞からの影響を受け、バイスタンダー効果が現れている可能性がある。以上の結果より、照射・非照射細胞の双方に周期に依る照射影響が現れることがわかった。
