Calixarene-assisted protein refolding via liquid-liquid extraction

カリックスアレーンを用いた液-液抽出法によるタンパク質のリフォールディング

下条 晃司郎   ; 大島 達也*; 長縄 弘親  ; 後藤 雅宏*

Shimojo, Kojiro; Oshima, Tatsuya*; Naganawa, Hirochika; Goto, Masahiro*

この論文ではカリックスアレーンを用いた液-液抽出法によるタンパク質のリフォールディングについて報告する。われわれはカリックス[6]アレーン酢酸誘導体が油-水界面で変性シトクロムcと超分子錯体を形成することによって、8M尿素水溶液から有機相へ変性シトクロムcを定量的に抽出可能であることを明らかにした。その結果、変性シトクロムcは完全に変性剤と分離され、さらにカリックスアレーンとの錯形成により、変性タンパク質同士の分子間相互作用が妨げられるため、凝集も抑制された。また、適量の1-ブタノールを含む弱酸性溶液を回収水相にすることにより、定量的に有機相からシトクロムcを逆抽出することに成功した。紫外・可視分光光度計,CDスペクトル,蛍光光度計による構造解析を行った結果、回収されたシトクロムcはその立体構造を天然状態まで回復しており、アスコルビン酸による還元活性は72%まで回復していることが明らかとなった。

We have found that a calix[6]arene acetic acid derivative forms a supramolecular complex with urea-denatured cytochrome c at the oil-water interface, which enables quantitative transfer of the protein from an 8 M urea aqueous solution into an organic phase through a proton-exchange mechanism. Denatured cytochrome c is completely separated from the denaturant, and is isolated from other denatured cytochrome c molecules to suppress the generation of aggregates due to protein-protein interactions. The recovery of cytochrome c from the organic phase is successfully achieved under acidic conditions using an appropriate amount of 1-butanol. UV-visible, CD, and fluorescence spectroscopic characterizations demonstrate that cytochrome c transferred into a denaturant-free aqueous solution regains its native structure. The reduction kinetics of refolded cytochrome c using ascorbic acid indicates that the protein provides approximately 72% of native activity as an electron-transfer protein.