Effective perdeuteration of ADP ribose pyrophosphatase (ADPRase) for neutron crystallography

中性子結晶構造解析のためのADPリボースピロフォスファターゼ(ADPRase)の効果的な重水素化

安達 基泰; 玉田 太郎; 大賀 拓史*; 倉光 成紀*; 黒木 良太

Adachi, Motoyasu; Tamada, Taro; Oga, Takushi*; Kuramitsu, Seiki*; Kuroki, Ryota

ADPリボースピロフォスファターゼ(ADPRase)は、ADPリボースをリボース5リン酸とAMPに加水分解する酵素である。本研究では、中性子結晶構造解析によって、ADPRaseの触媒反応に関与する水分子の役割や解離性アミノ酸のイオン化状態を明らかにし、触媒機構を詳細に解明することを目的としている。タンパク質の水素原子を重水素化することにより、中性子回折データのSN比が大きく改善される。大腸菌を用いて完全重水素化組換え型ADPRaseを調製した結果、2リットルの培養液から38mgのタンパク質の調製に成功した。結晶化を実施したところ、0.50.30.2mmの大きさの結晶を得ることができた。現在、結晶化条件の最適化を行っている。

ADP ribose pyrophosphatase (ADPRase) is an enzyme that catalyzes the hydrolysis of ADP ribose to ribose 5'-phosphate and AMP. Our objective is to understand the catalytic mechanism of ADPRase, including ionization state of catalytic residues and role of water molecules on the catalytic reaction, by neutron crystallography. We have attempted the perdeuteration of ADPRase using an Escherichia coli BL21(DE3) expression system and perdueterated BioExpress U-D medium (CIL Inc.). The cultivation condition was optimized to obtain maximum yield of perdueterated ADPRase. ADPRase expressed in this system was purified to homogeneity. The final yield of perdeuterated ADPRase was 38 mg from 2 liter cultivation. The perdeuterated ADPRase was then crystallized in sodium acetate buffer (pD5.5) resulting in single crystals of dimensions 0.50.30.2 mm. Optimization of the crystallization condition for X-ray and neutron crystallography is in progress.