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論文

Structure analysis and derivation of deformed electron density distribution of polydiacetylene giant single crystal by the combination of X-ray and neutron diffraction data

田代 孝二*; 日下 勝弘*; 細谷 孝明*; 大原 高志; 塙坂 真*; 吉澤 功徳*; 山元 博子*; 新村 信雄*; 田中 伊知朗*; 栗原 和男*; et al.

Macromolecules, 51(11), p.3911 - 3922, 2018/06

 パーセンタイル:100(Polymer Science)

The crystal structure of polydiacetylene giant single crystal has been analyzed on the basis of the two different methods of wide-angle neutron diffraction and X-ray diffraction. The X-ray result gives us the total electron density distribution. The neutron result tells the positions of atomic nuclei. As a result, the so-called bonded (or deformed) electron density, i.e., the electron density distribution due to the conjugation among the covalently bonded atoms along the polymer chain, can be estimated using the two information. The present report is the first example of the application of X-N method to the synthetic polymer species.

論文

TRAIL-R2 superoligomerization induced by human monoclonal agonistic antibody KMTR2

玉田 太郎; 新見 大輔*; 池田 昌弘*; 米澤 悌*; 片岡 之郎*; 黒木 良太; 森 英治*; 元木 一宏*

Scientific Reports (Internet), 5, p.17936_1 - 17936_12, 2015/12

 被引用回数:13 パーセンタイル:31.6(Multidisciplinary Sciences)

完全ヒトモノクローナル抗体KMTR2は、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド受容体2(TRAIL-R2)に対して強いアゴニスト単体活性(架橋剤無しでアポトーシス細胞死を誘導)を示す。KMTR2によるアゴニスト単体活性発現メカニズムを明らかにすることを目的として、TRAIL-R2の細胞外領域とKMTR2のFabフラグメント(KMTR2-Fab)の複合体結晶構造を2.1${AA}$分解能で決定した。結晶中において、KMTR2-Fab2分子は結晶学的2回対称に基づき軽鎖のCDR2領域間で会合していたが、この会合がTRAIL-R2重合を促進していると着想した。この着想を実証するために、CDR2間に存在するAsn53をArgに置換した変異体を作製し、種々の機能解析を実施した。その結果、Arg変異体は抗原結合能を保持したまま、アポトーシス誘導活性を失うことが判明した。よって、着想したとおり、結晶学的2回対称に基づくKMTR2の二量体化が核となることでTRAIL-R2の超重合状態が惹起され、腫瘍細胞の細胞死を誘導するアゴニスト活性を発現していることを明らかにした。

論文

中性子結晶構造解析で明らかになったビリン還元酵素PcyA基質複合体の2つの水素化状態と構造的特徴

海野 昌喜*; 杉島 正一*; 和田 啓*; 萩原 義徳*; 日下 勝弘*; 玉田 太郎; 福山 恵一*

日本結晶学会誌, 57(5), p.297 - 303, 2015/10

シアノバクテリアや植物のような光合成生物は、細胞内にビリン色素と呼ばれる光を集める色素をもっている。そのビリン色素を分子内にもつタンパク質のいくつかは、シアノバクテリアなどでは光合成、高等植物では開花や紅葉・落葉などをコントロールするシグナル伝達の役割を担う。フィコシアノビリン(PCB)はその両方に使われる重要なビリン色素の1つであり、PCBはヘム分解産物であるビリベルジン(BV)から、フェレドキシンにより供給される電子を使って酵素PcyAにより合成される。今回、我々はシアノバクテリア由来PcyAの立体構造をBVとの複合体状態で中性子結晶解析により決定した。BVは2つの状態(通常の状態と1つ水素が付いたBVH$$^{+}$$の状態)で存在していたが、近接したPcyA中のAsp105もBVの状態に対応して2つの状態(プロトン化および解離状態)で存在していた。さらに、BV近傍のHIs88とHis74間にヒドロニウムイオンが存在することを観察できた。また、中性子解析の結果はX線解析における照射損傷の影響も明らかにした。

論文

Evaluation of the resolvable capacity of Bragg reflections for a new diffractometer at J-PARC/MLF designed for protein crystals with large unit cells

友寄 克亮; 栗原 和男; 玉田 太郎; 黒木 良太

JPS Conference Proceedings (Internet), 8, p.036004_1 - 036004_6, 2015/09

J-PARC/MLFにおいて、250${AA}$格子長をもつ長格子蛋白質結晶の中性子回折データの収集を行うため、飛行時間型の高分解能生体高分子用中性子回折計の建設を計画している。我々は、250${AA}$格子長とd$$_{min}$$=2.0${AA}$の反射をターゲットとしたデータ収集を実現するために、適切な線源として非結合型減速材を選択することとした。必要な中性子フラックスおよびパルス幅を考慮し、我々は、減速材、中性子ガイド、サンプルサイズ、中性子検出器を含む単純な装置モデルを考え、ブラッグ反射の分離性能とJ-PARC/MLFでの長格子蛋白質結晶を対象にした新しい回折計設計のための装置パラメータの評価を行った。長格子蛋白質結晶のブラッグ反射分離には、散乱角の増加とともに全飛行距離の延長することが有効である。一方、中角領域(2$$theta$$$$approx$$90$$^{circ}$$)での分解可能な検出能を確保するためには、角度発散角を制限することが必要になる。減速材とガイド管の見込む最大角$$approx$$0.2$$^{circ}$$の場合、散乱角(2$$theta$$$$approx$$90$$^{circ}$$)から背面バンクの散乱角領域で、格子長250${AA}$を超える蛋白質結晶のd$$_{min}$$=2.0${AA}$の反射が、分離可能となり得ることが分かった。

論文

High-resolution crystal structures of the solubilized domain of porcine cytochrome $$b_{5}$$

平野 優; 木村 成伸*; 玉田 太郎

Acta Crystallographica Section D, 71(7), p.1572 - 1581, 2015/07

 パーセンタイル:100(Biochemical Research Methods)

哺乳類のミクロソームに存在するシトクロム$$b_{5}$$は、様々な電子伝達反応ではたらく複数の電子伝達パートナーとの間で電子伝達を行う。ブタ肝臓由来シトクロム$$b_{5}$$のヘム結合水溶性ドメインを用い、2種類の結晶系で酸化還元両状態について4つの結晶構造を0.76-0.95${AA}$分解能の高分解能で決定した。高分解能構造により、いくつかのアミノ酸残基において水素原子の電子密度をはっきりと観測することができた。また原子間結合距離の制約をはずした構造精密化により、ヘムプロピオン酸のプロトン化状態がヘムの電子状態制御に関わっていることが示唆された。酸化型と還元型の比較では、ヘム鉄の配位環境にほとんど差が見られなかった。しかしながら、酸化型と還元型の構造では、軸配位子His68周辺の水素結合ネットワークに差が見られたため、His68周辺の水素結合ネットワークはヘムの酸化還元状態制御に関わっている可能性があると考えられた。

論文

Insights into the proton transfer mechanism of a bilin reductase PcyA following neutron crystallography

海野 昌喜*; 石川 久美子*; 日下 勝弘*; 玉田 太郎; 萩原 義徳*; 杉島 正一*; 和田 啓*; 山田 太郎*; 友寄 克亮; 細谷 孝明*; et al.

Journal of the American Chemical Society, 137(16), p.5452 - 5460, 2015/04

 被引用回数:14 パーセンタイル:35.42(Chemistry, Multidisciplinary)

シアノバクテリアや高等植物等の光合成生物は細胞内にビリン色素と呼ばれる集光色素を有している。ビリン還元酵素PcyAはビリベルジン(BV)を2段階で還元する反応を触媒することによりビリン色素の1つであるフィコシアノビリンを合成する。今回、我々はシアノバクテリア由来PcyAの立体構造をBVとの複合体状態で中性子結晶解析により決定した。BVは2つの状態(通常の状態と1つ水素が付いたBVH$$^{+}$$の状態)で存在していたが、近接したPcyA中のAsp105もBVの状態に対応して2つの状態(プロトン化および解離状態)で存在していた。また、X線構造解析では照射還元により確認できなかったBV中のA環近くの「アキシアル」水分子の存在を確認することができた。さらに、BV近傍に位置するHis88がプロトン化状態で存在しBV中のA環のラクタム酸素と水素結合を形成していることも確認したが、このHis88と隣接したHis74の間の水分子がH$$_{3}$$O$$^{+}$$の状態で存在することも明らかにした。これらの知見はAsp105, His88および「アキシアル」水分子がPcyAによる触媒反応におけるプロトン移動に関与していることを示唆しており、フィコシアノビリン合成(初期段階)の新たな反応機構の提唱を可能とした。

論文

Structure of a highly acidic $$beta$$-lactamase from the moderate halophile ${it Chromohalobacter}$ sp.560 and the discovery of a Cs$$^{+}$$-selective binding site

新井 栄揮; 米澤 悌*; 岡崎 伸生*; 松本 富美子*; 柴崎 千枝; 清水 瑠美; 山田 貢*; 安達 基泰; 玉田 太郎; 河本 正秀*; et al.

Acta Crystallographica Section D, 71(3), p.541 - 554, 2015/03

 被引用回数:3 パーセンタイル:56.64(Biochemical Research Methods)

蛋白質を利用した希少・有害金属捕集材料の研究開発の一環として、中度好塩菌Chromohalobacter sp.560由来・高酸性$$beta$$-Lactamase(HaBLA)のX線結晶構造を解明するとともに、X線異常分散測定により、HaBLA分子上のCs$$^{+}$$, Sr$$^{2+}$$結合部位の抽出を試みた。PFのNW3AにてHaBLAのX線結晶構造を解明した後、Cs吸収端($$lambda$$=2.175${AA}$)近傍のX線を利用できるSAGA-LSのBL7やPFのBL17A、及び、Sr吸収端($$lambda$$=0.770${AA}$)近傍のX線を利用できるSPring-8のBL38B1やPFのBL5Aなどを使用して、HaBLA分子に結合したCs$$^{+}$$及びSr$$^{2+}$$を同定した。その結果、HaBLA分子上に少なくとも1ヶ所のCs$$^{+}$$結合部位、3ヶ所のSr$$^{2+}$$結合部位を発見した。特に、今回発見したCs$$^{+}$$結合部位は、Na$$^{+}$$がCs$$^{+}$$の9倍量存在する条件下(Na$$^{+}$$/Cs$$^{+}$$ = 90mM/10mM)でもCs$$^{+}$$を選択的に結合できることが明らかになった。このCs$$^{+}$$選択的結合部位は、Trp側鎖のベンゼン環によるカチオン-$$pi$$相互作用、および、主鎖の2つの酸素原子によってCs$$^{+}$$を結合していた。本研究で得たCs$$^{+}$$結合部位の立体構造情報は、原発事故によって放出された放射性Cs$$^{+}$$を捕集する蛋白質材料の設計(人工的Cs$$^{+}$$結合部位の設計)の土台として利用できる。

論文

Structural basis for acceptor-substrate recognition of UDP-glucose: anthocyanidin 3-${it O}$-glucosyltransferase from ${it Clitoria ternatea}$

廣本 武史; 本庄 栄二郎*; 野田 尚信*; 玉田 太郎; 数馬 恒平*; 鈴木 正彦*; Blaber, M.; 黒木 良太

Protein Science, 24(3), p.395 - 407, 2015/03

 被引用回数:19 パーセンタイル:18.95(Biochemistry & Molecular Biology)

チョウマメの花弁に含まれるUDP-glucose: anthocyanidin 3-${it O}$-glucosyltransferase(UGT78K6)は、UDP-glucoseを糖供与体とし、青色色素の基本骨格をなすデルフィニジンへの糖転移を触媒する酵素である。本酵素は、「フラボノール」に類似した化学構造を有するにもかかわらず、デルフィニジンなど「アントシアニジン」特異的な糖転移活性を示す。その糖受容体認識に関わる構造基盤を明らかにするため、UGT78K6単独の立体構造ならびに各糖受容体(アントシアニジンに分類されるデルフィニジンとペチュニジン、またフラボノールの一種であるケンフェロール)が結合した複合体の立体構造をX線結晶構造解析により決定した。今回の研究で見出された糖受容体の結合様式は、これまでに報告されている類似の糖転移酵素(赤ブドウ由来${it Vv}$GT1)とケンフェロールとの結合様式とは全く異なるものであり、発色の異なる糖受容体「アントシアニジン」と「フラボノール」をどのように識別しているのか、その分子メカニズムの解明を可能とした。今後、得られた構造情報を基に糖受容体との相互作用部位を改変することにより、色味の異なる色素化合物の合成あるいは医薬品候補分子の合成を可能にするものと期待される。

論文

Background elimination using the SNIP algorithm for Bragg reflections from a protein crystal measured by a TOF single-crystal neutron diffractometer

友寄 克亮; 平野 優; 栗原 和男; 玉田 太郎

Journal of Physics; Conference Series, 664, p.072049_1 - 072049_7, 2015/00

 被引用回数:2 パーセンタイル:23.08

蛋白質等の生体高分子の単結晶回折測定において、プロファイル関数を用いた積分法は弱いブラッグ反射の積分強度精度の向上に有効な手法であり、大強度陽子加速器施設(J-PARC)をはじめとする国内外の大強度パルス中性子線源に設置された単結晶回折装置における回折データ処理においても、その有効性が期待されている。本手法を中性子回折データ処理に適応する場合、水素原子の非干渉性散乱由来の強いバックグラウンドを正確に見積もることが鍵となる。我々は、バックグラウンド評価の際に、統計的に強度の弱いピークを認識するだけでなく、データソーススペクトルからの複数次元(x, y, TOF)のバックグラウンドの除去が可能なSNIP(Statistics-sensitive Nonlinear Iterative Peak-clipping)アルゴリズムを適用することを提案している。本研究では、蛋白質のパルス中性子回折実験で得られた実データのソーススペクトルに対して本アルゴリズムを適用することによるバックグラウンド除去を試みた。次に、TOFのピーク形状を忠実に再現するランダウあるいはバビロフ関数をガウス関数に畳み込んだ関数を、バックグラウンドを除去した一次元TOFヒストグラムデータに適用することにより、回折ピークへのフィッティングと積分を試みた。その結果、蛋白質結晶中の水素原子に起因する強いバックグラウンドに対して、空間方向だけでなく波長によってピーク幅が異なるTOF方向に対しても精度よくバックグラウンド除去が可能であることが分かった。

論文

広角X線回折および広角中性子回折に基づく高分子結晶構造の精密解析

田代 孝二*; 塙坂 真*; 山元 博子*; Wasanasuk, K.*; Jayaratri, P.*; 吉澤 功徳*; 田中 伊知朗*; 新村 信雄*; 日下 勝弘*; 細谷 孝明*; et al.

高分子論文集, 71(11), p.508 - 526, 2014/11

 被引用回数:3 パーセンタイル:79.68(Polymer Science)

高分子結晶構造の詳細を、水素原子位置まで含めて明らかにすることを目的とし、高エネルギーX線および中性子回折データの収集ならびにそれらの解析結果を、さまざまの結晶性高分子を例として総合的に記述した。まず、最近にまで至る高分子構造解析手法の発展について概要を述べるとともに、それらの各段階における問題点について考察した。斜方晶型ポリエチレン、アタクティックポリビニルアルコール、ポリ乳酸およびそのステレオコンプレックスなど、いろいろの意味で重要な高分子について、これまでに提案されてきた構造を再吟味するとともに、新たに提案した構造について記述した。水素原子位置についても精確に決定された場合は、それらの構造情報に基づく極限力学物性の定量的予測を行った。さらにはポリジアセチレンの場合について、X線および中性子構造解析によって得られた精密な電子密度分布および原子位置座標の情報にいわゆるX-N法を適用し、主鎖骨格に沿った結合電子密度分布についての導出についても言及した。構造物性相関解明における高分子結晶構造解析の今後の展開についても言及した。

論文

Evaluation of intensity and pulse width of different moderators for designing a new diffractometer for protein crystals with large unit cells in J-PARC/MLF

友寄 克亮; 日下 勝弘*; 山田 太郎*; 玉田 太郎

Journal of Structural and Functional Genomics, 15(3), p.131 - 135, 2014/09

J-PARCの物質生命科学施設(MLF)に、250${AA}$を超える単位胞を持つ結晶からの回折データ収集を可能とする生体高分子専用高分解能単結晶中性子回折装置の設計を計画している。この新しい回折計は、膜蛋白質や超分子などの巨大蛋白質の詳細構造解析のために利用される予定である。パルス幅時間分解能を考慮し、結合型減速材(CM)と非結合型減速材(DM)の強度およびパルス幅の定量的な比較を行った結果、CMよりもむしろDMが我々の目指す回折計の基準を満たすことが分かった。この結果は狭いパルス幅をもつDMが、大型単位格子をもつ結晶からのブラッグ反射の分離には、必要不可欠であることを示唆するものである。一方で、特に、大型単位格子の場合にはDMからの弱い信号が、水素原子の非干渉性散乱によって引き起こされる高いレベルのバックグランドの下に埋没してしまうということも念頭に置かねばならない。我々は、時間方向のパルス形状を忠実に再現するためのエネルギー損失関数とStatistics-sensitive Nonlinear Iterative Peak-clipping法による精度の高いバックグラウンド除去法を組み合わせた反射積分方法を提案する。

論文

定常炉中性子源を用いた生体高分子用単結晶回折装置

栗原 和男; 玉田 太郎

波紋, 24(3), p.190 - 199, 2014/08

中性子源強度の低さに加えて生体高分子結晶の回折能の弱さを克服するために、生体高分子に対する中性子結晶構造研究の分野においては、これまでに数々の装置・技術が開発されてきた。例えば、弾性湾曲完全結晶シリコンモノクロメータは試料位置での入射中性子強度の増大に貢献し、2次元中性子検出器である中性子イメージングプレート(NIP)は、検出面積の大型化をもたらした。特に、NIPの開発成功はこの研究分野でのブレークスルーとなった。さらに、その後の低温環境下での測定や大型結晶の育成、試料の重水素化に対する技術の進歩は、さらなる回折測定効率の向上につながっている。現在、研究用原子炉で稼働している生体高分子用中性子回折装置は世界全体で6台まで増えてきた(加えて1台がコミッショニング中。また、パルス中性子源で稼働する回折装置は3台)。このように、中性子結晶構造解析は生体高分子の立体構造研究のための一般的に使われる手法になろうとしている

論文

Structural characteristics of alkaline phosphatase from the moderately halophilic bacterium ${it Halomonas}$ sp.593

新井 栄揮; 米澤 悌*; 石橋 松二郎*; 松本 富美子*; 安達 基泰; 玉田 太郎; 徳永 廣子*; Blaber, M.; 徳永 正雄*; 黒木 良太

Acta Crystallographica Section D, 70(3), p.811 - 820, 2014/03

 被引用回数:4 パーセンタイル:53.34(Biochemical Research Methods)

中度好塩菌${it Halomonas}$ sp.593のペリプラズム蛋白質Alkaline phosphatase(HaAP)は、他の好塩性Alkaline phosphataseと異なり、幅広い塩濃度域(1$$sim$$4M NaCl)において機能発現が可能である。そこで本研究では、HaAPの構造学的特徴と好塩性の関係を理解するために、HaAPのX線結晶解析を行った。分解能2.1${AA}$, 空間群${it P}$2$$_{1}$$, 格子定数${it a}$=52.7${AA}$, ${it b}$=147.0${AA}$, ${it c}$=58.3${AA}$, $$alpha$$=90$$^{circ}$$, $$beta$$=105.2$$^{circ}$$, $$gamma$$=90$$^{circ}$$, R$$_{merge}$$ 8.4%の回折データを取得して、生物学的構造単位であるHaAP二量体の立体構造を解明することに成功した。また、HaAPの立体構造を、PDB中で最も配列相同性が高い低度好塩菌${it Vibrio}$ sp.由来VAP(identity 70.0%)の立体構造と比較した。その結果、ASA$$>$$0${AA}$ $$^{2}$$の酸性アミノ酸(D, E)の数は、VAP(57個)よりもHaAP(72個)が多いことが明らかになった。また、VAPとHaAPを構成する疎水性アミノ酸(V, L, I, P, F, M, W)に着目すると、二量体界面に位置する疎水性アミノ酸の数はほぼ同じ(39個と40個)であったが、分子内部(ASAが0${AA}$)の疎水性アミノ酸はそれぞれ24個と37個であった。このようなHaAPにおける分子表面の高い酸性アミノ酸含量や分子内部の高い疎水性アミノ酸含量は、中度好塩菌のペリプラズム特有の幅広い塩濃度環境下(0.5M$$sim$$飽和塩濃度)における高い可溶性と機能発現の両立に寄与していると考えられる。

論文

Structural and functional characterization of the ${it Geobacillus}$ copper nitrite reductase; Involvement of the unique N-terminal region in the interprotein electron transfer with its redox partner

福田 庸太*; 小手石 泰康*; 米田 涼平*; 玉田 太郎; 高見 英人*; 井上 豪*; 野尻 正樹

Biochimica et Biophysica Acta; Bioenergetics, 1837(3), p.396 - 405, 2014/03

 被引用回数:9 パーセンタイル:50.12(Biochemistry & Molecular Biology)

海洋性好熱菌${it Geobacillus kaustophilus}$ HTA426由来銅型亜硝酸還元酵素(CuNIR)の全長体およびN末端領域(68アミノ酸)欠損変異体の結晶構造を各々1.3${AA}$、および1.8${AA}$分解能で決定した。全体構造は既知のCuNIRと同様に2つのグリークキー$$beta$$バレルドメインから構成されていたが、N末端側に$$beta$$ストランドと$$alpha$$へリックスからなる本酵素に特異的な領域が存在していた。この領域はタイプ1銅結合部位の方に伸びており、他の脱窒系におけるCuNIRと酸化還元パートナーである電子供与体(チトクロム${it C$_{551}$}$)との電子伝達複合体構造との重ね合わせから、この領域が${it Geobacillus}$脱窒系の電子伝達反応における電子供与体との一時的な結合に寄与していることが推察された。さらに、N末端領域欠損変異体と${it Geobacillus}$を由来チトクロム${it C$_{551}$}$を用いた電子伝達反応の速度論的解析結果を組み合わせた結果、この領域が電子供与体の認識に直接関与していることが示された。

論文

High-resolution crystal structure of copper amine oxidase from ${it Arthrobacter globiformis}$; Assignment of bound diatomic molecules as O$$_{2}$$

村川 武志*; 林 秀行*; 角南 智子; 栗原 和男; 玉田 太郎; 黒木 良太; 鈴木 守*; 谷澤 克行*; 岡島 俊英*

Acta Crystallographica Section D, 69(12), p.2483 - 2494, 2013/12

 被引用回数:8 パーセンタイル:35.2(Biochemical Research Methods)

アルスロバクター-グロビフォルミス由来銅アミン酸化酵素の結晶構造を抗凍結剤として低分子ポリエチレングリコール(LMW PEG; 平均分子量$$sim$$200)を用いて1.08${AA}$分解能で決定した。最終的な結晶構造学的$$R$$因子と$$R$$$$_{rm free}$$値は、それぞれ13.0%と15.0$$%$$であった。LMW PEGの幾つかの分子は、活性部位を含むタンパク質内部の空洞を占めており、それが分子全体の温度因子の著しい低下をもたらし、結果として、単量体分子量が約70,000と比較的大きなタンパク質にも拘わらず原子分解能の構造に至ったことがわかった。推定される全水素原子の約40%は、$$F$$$$_{rm o}$$-$$F$$$$_{rm c}$$差図中に明確な電子密度を持って観察され、複数のマイナーな配座異性体も多くの残基に対して同定された。また、翻訳後に誘導されたキノン補因子と銅原子を含む活性部位における異方的な変位の揺らぎを見積った。さらに、複数の二原子分子、恐らく分子性酸素がタンパク質と結合し、そのうちの一つは二量体界面の中央に位置する空洞から活性部位まで基質である二原子酸素のための進入経路として以前から提案されている領域に位置していた。

論文

Elucidations of the catalytic cycle of NADH-cytochrome $$b$$$$_{5}$$ reductase by X-ray crystallography; New insights into regulation of efficient electron transfer

山田 貢*; 玉田 太郎; 竹田 一旗*; 松本 富美子*; 大野 拓*; 小杉 正幸*; 高場 圭章*; 正山 祥生*; 木村 成伸*; 黒木 良太; et al.

Journal of Molecular Biology, 425(22), p.4295 - 4306, 2013/11

 被引用回数:14 パーセンタイル:44.93(Biochemistry & Molecular Biology)

NADHシトクロム$$b$$$$_{5}$$還元酵素(b5R)はNADHドメインとFADドメインの2つのドメインからなるフラボタンパク質で、NADHから二個の電子を受け取り、二分子のシトクロム$$b$$$$_{5}$$(Cb5)に一電子ずつ伝達する反応を触媒する。今回、ブタ肝臓由来b5Rの還元型および酸化型の両状態における結晶構造解析に成功した。嫌気環境下で作製した結晶を用いて1.68${AA}$分解能で解析した二電子還元型b5Rの構造は、酸化型と比較して2つのドメインの相対配置がわずかに変化しており、その結果、FADの溶媒露出面積が増大し、FADのイソアロキサジン環のN5原子と、FADからのプロトン放出に関わっていると考えられているThr66の側鎖の水酸基間に水素結合が形成していた。一方、イソアロキサジン環の平面性は、還元型においても酸化型と変わらず保持されており、NAD$$^{+}$$のニコチンアミド環とスタッキングしていた。また、0.78${AA}$分解能で解析した酸化型b5Rの構造から、Thr66を介したFADとHis49間の水素結合ネットワークが水素原子の位置情報と共に明らかになった。これらの構造的特徴は、b5Rの触媒サイクルにおいて、電子の逆流を防ぎ、Cb5のような電子受容体への電子移動を促進するものであった。さらに、クライオトラップ法により還元型結晶の大気暴露時間を制御し作製した結晶を用いた解析により、還元型から酸化型への再酸化反応は二段階を経ることが示唆された。

論文

Crystal structure of endo-1,4-$$beta$$-glucanase from ${it Eisenia foetida}$

有森 貴夫*; 伊藤 彰紘*; 中澤 昌美*; 上田 光宏*; 玉田 太郎

Journal of Synchrotron Radiation, 20(6), p.884 - 889, 2013/11

 被引用回数:11 パーセンタイル:34.45(Instruments & Instrumentation)

セルロースを含む木質バイオマスからのバイオエタノール生産における糖化プロセスにおいて、(293K以下でも十分な活性を示す)低温寛容性セルラーゼを用いることができれば、加熱するためのエネルギーを節約できるだけではなく、並行複発酵による高濃度アルコール生産が可能となる。GHファミリー9に属するシマミミズ由来1,4-$$beta$$-エンドグルカナーゼ(EF-EG2)は313Kにおいて最大活性を示すが、283Kにおいても比較的高い活性を保持する。酵母を用いた組換え型EF-EG2の発現系を構築し、引き続き試料精製および結晶化を実施したところ、回折実験可能な針状結晶を得ることに成功した。この結晶を用いて放射光施設において1.5${AA}$分解能の回折データを収集し、結晶学的$$R$$値が14.7%(free-$$R$$値が16.8%)まで精密化を完了した。EF-EG2の全体構造は($$alpha$$/$$alpha$$)$$_{6}$$バレルから成り、その中心に活性部位と想定されるクレフトが確認された。また、分子表面は負電荷に富んでいたが、この特徴は構造既知の低温寛容性酵素においても広く観察されており、EF-EG2の低温寛容性との関連が示唆された。

論文

Crystal structure of UDP-glucose:anthocyanidin 3-${it O}$-glucosyltransferase from ${it Clitoria ternatea}$

廣本 武史; 本庄 栄二郎*; 玉田 太郎; 野田 尚信*; 数馬 恒平*; 鈴木 正彦*; 黒木 良太

Journal of Synchrotron Radiation, 20(6), p.894 - 898, 2013/11

 被引用回数:23 パーセンタイル:14.15(Instruments & Instrumentation)

チョウマメの花弁には、テルナチンと呼ばれるポリアシル化アントシアニンが含まれている。その生合成の最初の段階を担うのがUDP-グルコース:アントシアニジン3-${it O}$-グルコシルトランスフェラーゼ(${it Ct}$3GT-A)であり、UDP-グルコースを糖供与体とし、糖受容体であるアントシアニジン類への糖転移反応を触媒する。ここでは${it Ct}$3GT-Aの構造機能相関を明らかにするため、${it Ct}$3GT-Aの大腸菌組換え体を調製し、その立体構造をX線結晶構造解析により1.85${AA}$分解能で決定した。その全体構造は、2つのRossmann-like $$beta$$/$$alpha$$/$$beta$$ドメインから成るGT-Bフォールドを有しており、また2つのドメイン間に形成されたクレフトには、糖供与体(UDP-Glc)および糖受容体を結合するキャビティが存在していた。既に報告されている赤ブドウ由来フラボノイド3-${it O}$-グリコシルトランスフェラーゼ(${it Vv}$GT1)との構造比較より、糖受容体であるケンフェロールの結合に関与するアミノ酸残基が${it Ct}$3GT-Aにおいて有意に置換されていることが明らかとなった。これらの知見は、両酵素の糖受容体特異性の差別化を理解する上で重要と考えられる。

論文

Neutron and X-ray crystallographic analysis of the human $$alpha$$-thrombin-bivalirubin complex at pD 5.0; Protonation states and hydration structure of the enzyme-product complex

山田 太郎*; 栗原 和男; 大西 裕季*; 玉田 太郎; 友寄 克亮; 桝見 賢司*; 田中 伊知朗*; 黒木 良太; 新村 信雄*

Biochimica et Biophysica Acta; Proteins and Proteomics, 1834(8), p.1532 - 1538, 2013/08

 被引用回数:5 パーセンタイル:76.43(Biochemistry & Molecular Biology)

$$alpha$$-トロンビン-ビバリルジン複合体のプロトン化状態と水和構造をX線(1.6${AA}$)/中性子(2.8${AA}$)単結晶回折データによる同時構造精密化により明らかにした。原子間距離については別途、1.25${AA}$のX線結晶構造解析により評価した。この複合体は、$$alpha$$-トロンビンの酵素・生成物(EP)複合体のモデルとなる。活性化部位周囲の中性子散乱長図は、H57/Hの側鎖が重水素化されていることを示唆する。この同時精密化により、H57/HのD$$delta$$1とD$$epsilon$$2の占有率がそれぞれ1.0と0.7であると示された。しかしながら、S195/Hのヒドロキシル基のO$$gamma$$周囲には有意な中性子散乱長密度が観察されなかった。また、そのO$$gamma$$は、dFPR-COOHのカルボキシル基炭素に近接していた。これらの観察から、S195/HのO$$gamma$$は脱プロトン化されており、EP複合体において求核性を維持していると示唆された。また、活性化部位に加えて、ビバリルジンの認識に関与するS1サブサイトとエキソサイトIに水和構造が存在することが分かった。

論文

Crystal structures of the catalytic domain of a novel glycohydrolase family 23 chitinase from ${it Ralstonia}$ sp. A-471 reveals a unique arrangement of the catalytic residues for inverting chitin hydrolysis

有森 貴夫*; 川本 乃理子*; 新家 粧子*; 岡崎 伸生*; 中澤 昌美*; 宮武 和孝*; 深溝 慶*; 上田 光宏*; 玉田 太郎

Journal of Biological Chemistry, 288(26), p.18696 - 18706, 2013/07

 被引用回数:16 パーセンタイル:39.64(Biochemistry & Molecular Biology)

${it Ralstonia}$ sp. A-471由来のキチナーゼC(Ra-ChiC)の活性ドメインはG型リゾチームと類似した配列を有し、他のキチナーゼとは異なりGHファミリー23に属する。しかしながら、NMRを用いた解析ではRa-ChiCはキチン二量体と相互作用する一方で、ペプチドグリカン断片とは相互作用しなかった。本論文では、Ra-ChiCの活性ドメイン(野生型, E141Q, E162Q変異体)及びキチンオリゴ糖複合体の結晶構造解析を報告する。Ra-ChiCは基質特異性をつかさどるトンネル構造を含む基質結合部位を有しており、そのトンネル上に位置するAsp226が塩基触媒として水分子を活性化する機構が構造情報に基づく変異体解析の結果から示唆された。構造的に高く保存された酸触媒として機能するGlu141とこのAsp226の相対配置は、他のGH23型酵素や反転型GH19キチナーゼとは異なっており、Ra-ChiCの特徴的な機能と関連していると考えられた。

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