完全重水素化T4ファージリゾチームの結晶大型化と中性子回折実験

A Preliminary neutron diffraction experiment using perduterated T4 phage lysozyme

廣本 武史; 安達 基泰; 柴崎 千枝; 黒木 良太

Hiromoto, Takeshi; Adachi, Motoyasu; Shibazaki, Chie; Kuroki, Ryota

T4ファージリゾチーム(T4L)は、大腸菌の細胞壁を構成するムラミルペプチドを加水分解し、溶菌を引き起こす酵素である。野生型T4Lは、加水分解後の生成物のアノマー構造を逆転する酵素であるが、26番目のThr残基を部位特異的にHis残基に置換したT26H変異型酵素は、加水分解生成物のアノマー構造を保持する酵素に変換されるのみならず、高い糖転移活性を獲得する。一般に糖加水分解酵素では、酸性残基の2つのカルボン酸がそれぞれ酸および塩基触媒として関与するが、T26H変異型酵素ではカルボン酸の代わりにヒスチジン側鎖が反応に関与する。そこで、変異型酵素に導入したHis残基の糖転移反応における役割と隣接する酸性残基(Asp20)との関係を中性子構造解析によって明らかにするため、野生型およびT26H変異型T4Lの完全重水素化とその大型結晶作製を試みたので報告する。それぞれの完全重水素化タンパク質は、一般的な大腸菌発現ベクター(pET-24a)を用い、完全重水素化培地で組換え大腸菌を培養後、過剰発現させることによって調製した。取得した試料を用いて、タンパク質濃度と沈殿剤濃度を変化させたスクリーニングを実施し、約0.1mmの結晶を取得した。本結晶をミュンヘン工科大学(FRM-II)において極低温下(100K)での予備的中性子回折実験を実施した結果、小型の結晶ではあるが2.5分解能を超える回折点の観測に成功した。

T4 phage lysozyme (T4L) is an endoacetylmuramidase that degrades the murein of the bacterial cell wall by cleavage of the -1,4-glycosidic bond between -acetylmuramic acid and -acetylglucosamine. We previously reported that the substitution of the catalytic Thr26 to the nucleophilic His converts the wild type (WT) T4L from an inverting to a retaining glycosidase, in which the -configuration of the substrate is retained in the product. It was also found that the Thr26His mutant T4L can catalyze the transglycosylation reaction more effectively than hydrolysis although the WT T4L has no transglycosidase activity. To clarify the role of the substituted His26 on transglycosylation and its relationship to the neighboring acidic residue Asp20 by neutron crystallography, the perdeuterated recombinant proteins of the WT and Thr26His mutant T4L were prepared for crystallization in this study. The perdeuterated forms were produced in cells cultured in deuterated rich media. After purification, macroseeding was performed to grow large crystals by transferring individual crystals to hanging drops. A crystal of Thr26His mutant T4L with a volume of 0.1 mm was grown after one month. Preliminary neutron-diffraction experiment at the research reactor FRM-II (Munich, Germany) at 100 K gave diffraction spots beyond 2.5 resolution for 1.5 hour exposure.