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論文

A Technique for determining the deuterium/hydrogen contrast map in neutron macromolecular crystallography

茶竹 俊行*; 藤原 悟

Acta Crystallographica Section D; Structural Biology (Internet), 72(1), p.71 - 82, 2016/01

 被引用回数:3 パーセンタイル:64.72(Biochemical Research Methods)

A technique for the determination of the deuterium/hydrogen (D/H) contrast map in neutron macromolecular crystallography has been developed and evaluated using ribonuclease A. In this technique, the contrast map between the D$$_{2}$$O-solvent and H$$_{2}$$O-solvent crystals is calculated using subtraction in real space. The present technique can thus utilize all the amplitudes of the neutron structure factors for both of the D$$_{2}$$O-solvent and H$$_{2}$$O solvent crystals. The neutron D/H contrast maps clearly demonstrate powerful detectability of the H/D exchange in proteins. In fact, alternative protonation states and alternative conformations of hydroxyl groups are observed at a medium resolution (1.8 AA ). Moreover, water molecules can be categorized into three types according to their tendency for rotational disorder. These results directly indicate improvement in the neutron crystal structure analysis. Combination of this technique with the conventional neutron structure determination protocols thus makes more precise and efficient determination of the D atom positions in proteins possible.

論文

Direct interactions between Z-DNA and alkaline earth cations, discovered in the presence of high concentrations of MgCl$$_{2}$$ and CaCl$$_{2}$$

茶竹 俊行*; 角南 智子

Journal of Inorganic Biochemistry, 124, p.15 - 25, 2013/07

 被引用回数:10 パーセンタイル:48.82(Biochemistry & Molecular Biology)

In this study, crystals of Z-DNA hexamer d(CGCGCG) complexed with MgCl$$_{2}$$ and CaCl$$_{2}$$ were obtained in the presence of high concentrations of alkaline earth salts (500 mM) using a temperature control technique, and their crystal structures were determined at 1.3${AA}$ resolution. Mg$$^{2+}$$ and Ca$$^{2+}$$ cations in these structures tend to interact directly with phosphate groups of Z-DNA duplexes; however, they tend to form water-mediated interactions with Z-DNA in the presence of lower concentrations of alkaline earth salts. In these crystals, a DNA duplex was laid along its c-axis and interacted with its 6 neighboring DNA duplexes through coordination bonds of P-O...(Mg$$^{2+}$$ or Ca$$^{2+}$$)...O-P. A symmetrical hexagonal Z-DNA duplex assembly model may explain DNA condensation caused by alkaline earth salts. These structures offer insights into the functions of alkaline earth cations essential to the structures and assembly of Z-DNA duplexes.

論文

An Approach to DNA crystallization using the thermal reversible process of DNA duplexes

茶竹 俊行*; 佐崎 元*; 亀甲 龍彦*; 藤原 悟; 石川 卓哉*; 松本 治*; 森本 幸生*

Crystal Growth & Design, 10(3), p.1090 - 1095, 2010/03

 被引用回数:4 パーセンタイル:48.86(Chemistry, Multidisciplinary)

温度上昇により二本鎖DNAから一本鎖DNAへの転移が起こる熱的可逆過程を用いたDNA結晶化技術を提案した。DNA8量体(dCGCGCG)結晶の溶解度及びその融解点と二本鎖DNAから一本鎖DNAへの転移過程の関係を調べた結果、この転移過程が溶解度上昇を引き起こすことが明らかとなった。この温度による溶解度制御技術を用いることにより、少量のDNAから良質の単結晶が生成できることが示された。簡単に適用可能なこの方法は、高価な装置を用いることなく結晶の溶解度を制御できるという点で、従来の蒸気拡散法より優れている。

論文

Functional aberration of myofibrils by cardiomyopathy-causing mutations in the coiled-coil region of the troponin-core domain

松本 富美子; 前田 佳代*; 茶竹 俊行*; 前田 雄一郎*; 藤原 悟

Biochemical and Biophysical Research Communications, 382(1), p.205 - 209, 2009/04

 被引用回数:13 パーセンタイル:61.86(Biochemistry & Molecular Biology)

心筋症発症に関連する筋収縮調節蛋白質トロポニンT(TnT)の2種類の変異体(E244D, K247R)の変異部位は、Tn-コア領域のコイルドコイル領域に存在する。この領域の変異がTnの調節機構に及ぼす影響を明らかにするために、TnTのこの部位でのさまざまな変異体を含む筋原繊維のカルシウム依存性ATP分解活性を測定した。その結果、疾病関連変異体E244Dは、カルシウム感受性を変化させずに最大ATP分解活性を増大させることを確認するとともに、変異体K247Rも同様の効果を持つことを初めて明らかにした。さらにさまざまな変異体(E244D, E244M, E244A, E244K, K247R, K247E, and K247A)は、カルシウム感受性の変化はないが、最大ATP分解活性についてさまざまな影響を与えることが明らかとなった。これらの変異体を含むTnコアの分子動力学計算の結果、変異部位付近の水素結合ネットワークがTnの機能発現に重要であることが示唆された。

論文

A Neutron crystallographic analysis of a cubic porcine insulin at pD 6.6

石川 卓哉*; 茶竹 俊行*; 大西 裕季*; 田中 伊知朗*; 栗原 和男; 黒木 良太; 新村 信雄*

Chemical Physics, 345(2-3), p.152 - 158, 2008/04

 被引用回数:12 パーセンタイル:56.54(Chemistry, Physical)

A neutron diffraction study has been carried out at 2.7 ${AA}$ resolution on cubic porcine insulin at pD 6.6 using the BIX-4 at the JRR-3 reactor of JAEA. The ionization states of several amino acids in porcine insulin have been obtained at pD 6.6 and they are compared with those at pD 9 obtained by neutron diffraction as well as those at pH 6.50 and 6.98 obtained by X-ray diffraction. For the present work, a large single crystal of 2.7 mm$$^{3}$$ was obtained by dialysis. Refinement of the structure was carried out and the ${it R}$-factor was 21.4% with the free ${it R}$ being 29.4%. Protonation and deprotonation of various ionizable amino acid residues were observed and discussed on the basis of the charged states estimated by the ${it pK$_{a}$}$ values. In the case of His${it B}$5, both N$$pi$$ and N$$tau$$ of an imidazole ring are protonated at pD 6.6, but at pD 9 only N$$pi$$ is protonated. In contrast, for His${it B}$10, both N$$pi$$ and N$$tau$$ are protonated at pD 6.6 as well as at pD 9.

論文

Protonation states of buried histidine residues in human deoxyhemoglobin revealed by neutron crystallography

茶竹 俊行*; 柴山 修哉*; Park, S. Y.*; 栗原 和男; 玉田 太郎; 田中 伊知朗*; 新村 信雄*; 黒木 良太; 森本 幸生*

Journal of the American Chemical Society, 129(48), p.14840 - 14841, 2007/12

 被引用回数:22 パーセンタイル:39.85(Chemistry, Multidisciplinary)

A large crystal of human deoxy hemoglobin (Hb) was grown from D$$_{2}$$O solution (pD 6.3). The preliminary neutron diffraction experiment was carried out at the KUR reactor in RRI of Kyoto University, and the diffraction data set to 2.1 ${AA}$ resolution was collected at JRR-3 reactor in JAEA using the BIX-3. The neutron crystal structure of Hb reveals that both the $$alpha$$- and $$beta$$-distal histidines (His$$alpha$$58 and His$$beta$$63) adopt fully (doubly) protonated form. This finding sharply contrasts with existing results on R (relaxed) state liganded Hbs where such full protonation can never occur. This results suggest an interesting possibility that the both histidines could contribute to the T (tense) state Bohr effect of Hb. Indeed, the protonation/deprotonation of each distal histidine may have a direct impact on the oxygen affinity of the nearby heme group through sterical hindrance and/or polarity change in the heme pocket without affecting the allosteric equilibrium of Hb.

論文

中性子結晶解析によって観測されたB型DNAの水和水の配向

新井 栄揮; 茶竹 俊行*; 新村 信雄

日本結晶学会誌, 48(2), p.133 - 139, 2006/04

本研究ではB型DNA+量体d(CCATTAATGG)$$_{2}$$について、X線及び中性子結晶構造解析を行い、多くの水和水について水素原子位置を含めて決定することに成功した。DNA二重らせん周辺の水和パターンは、核酸の構造と機能に重要な役割を果たすと考えられている。特に、AT塩基対が連なる領域のMinor groove(副溝)内には、六角形状の水和パターンが存在することが知られていた。しかし、それはX線結晶回折によって明らかにされた水分子の酸素原子位置から予想されたものであった。今回、水和水の水素原子位置が決定できたことにより、水分子の配向を含めた詳細な水和水ネットワークの様子が明らかになった。これにより、水和パターンは単純な六角形だけでは表せず、これまでの予想よりも数多くの水素結合がDNA鎖-水分子間に存在することが明らかになった。

論文

Recent results on hydrogen and hydration in biology studied by neutron macromolecular crystallography

新村 信雄; 新井 栄揮; 栗原 和男; 茶竹 俊行*; 田中 伊知朗*; Bau, R.*

Cellular and Molecular Life Sciences, 63(3), p.285 - 300, 2006/02

 被引用回数:39 パーセンタイル:60.89(Biochemistry & Molecular Biology)

中性子回折は蛋白質やDNAの水素位置を直接的に決定する実験手法である。三つの異なったタイプの生体物質用高分解能中性子回折計が日本,フランス,アメリカに建設され、それらは近年、多くの蛋白質の結晶構造を決定するために頻繁に用いられてきた。本論文では、詳細な水素結合のジオメトリー,蛋白質及び核酸のH/D交換に関する情報,プロトンの正確な位置決定,酵素活性及び熱安定性における水素原子の役割,水和構造の動力学的挙動など、中性子構造解析から引出された成果を取り上げる。その他の重要な技術として開発された、結晶化相図による大型単結晶育成の最適化,完全重水素化蛋白質の調製,中性子蛋白質結晶学におけるクライオ技術の導入,生体水素水和水データベースの設立なども本論文中にて議論する。

論文

Complicated water orientations in the minor groove of the B-DNA decamer d(CCATTAATGG)$$_{2}$$ observed by neutron diffraction measurements

新井 栄揮; 茶竹 俊行*; 大原 高志; 栗原 和男; 田中 伊知朗*; 鈴木 喜大*; 藤本 瑞*; 水野 洋*; 新村 信雄

Nucleic Acids Research, 33(9), p.3017 - 3024, 2005/05

 被引用回数:87 パーセンタイル:15.72(Biochemistry & Molecular Biology)

本研究ではB型DNA十量体d(CCATTAATGG)$$_{2}$$について、X線及び中性子結晶構造解析を行い、多くの水和水について水素原子位置を含めて決定することに成功した。DNA二重らせん周辺の水和パターンは、核酸の構造と機能に重要な役割を果たすと考えられている。特に、AT塩基対が連なる領域のMinor groove(副溝)内には、六角形状の水和パターンが存在することが知られていた。しかし、それはX線結晶回折によって明らかにされた水分子の酸素原子位置から予想されたものであった。今回、水和水の水素原子位置が決定できたことにより、水分子の配向を含めた詳細な水和水ネットワークの様子が明らかになった。これにより、水和パターンは単純な六角形だけでは表せず、これまでの予想よりも数多くの水素結合がDNA鎖-水分子間に存在することが明らかになった。

論文

Hydrogen and hydration in proteins and nucleic acids; Neutron diffraction from bio-macromolecules at JAERI

新村 信雄; 新井 栄揮; 栗原 和男; 茶竹 俊行*; 田中 伊知朗*; Bau, R.*

Hydrogen- and Hydration-Sensitive Structural Biology, p.17 - 35, 2005/00

原研において、われわれは生体高分子のための幾つかの高分解能中性子回折計(BIX-type回折計)を建設した。この論文では、BIX-type回折計で得られた、蛋白質中の水素位置及び水和に関する幾つかの興味深い結果について再考する。中性子蛋白質結晶学の一般的な話題が著者らによって再考され、選ばれた幾つかのトピックスが議論される。

論文

A Neutron crystallographic analysis of a rubredoxin mutant at 1.6 ${AA}$ resolution

茶竹 俊行*; 栗原 和男; 田中 伊知朗*; Tsyba, I.*; Bau, R.*; Jenney, F. E. Jr.*; Adams, M. W. W.*; 新村 信雄

Acta Crystallographica Section D, 60(8), p.1364 - 1373, 2004/08

 被引用回数:30 パーセンタイル:11.54(Biochemical Research Methods)

${it Pyrococcus furiosus}$由来ルブレドキシンの高い熱安定性の起源を明らかにするため、その変異型に対する1.6${AA}$分解能中性子結晶構造解析(重水中で結晶育成)を生体高分子用中性子回折装置BIX-3(原研原子炉JRR-3内設置)を用いて行った。${it P. furiosus}$由来ルブレドキシンは、通常の熱安定性を持つ常温菌由来のルブレドキシンと異なるアミノ酸残基部分を持つ。そこで、その中で重要と考えられる3つの残基を常温菌のものに変えた変異型を発現させ、その水素結合パターンを変異の無い野生型と比較した。その結果、変異を行った残基の一つで水素結合パターンの違いが明らかになった。これをもとに熱安定性の議論を行った。一方で、このタンパク質の水素/重水素置換率の詳細も調べた。その結果、ルブレドキシンの鉄-硫黄中心(酸化還元機能を司る)にかかわる4つのシステイン残基周辺は、最も水素/重水素置換が進んでいないということがわかった。これはこの周囲の構造が安定であることを示唆している。加えて、この高分解能な中性子構造解析により、水和水の秩序性も含めた詳細な水和構造が明らかになった。

論文

Neutron crystallographic study on rubredoxin from ${it Pyrococcus furiosus}$ by BIX-3, a single-crystal diffractometer for biomacromolecules

栗原 和男; 田中 伊知朗*; 茶竹 俊行*; Adams, M. W. W.*; Jenney, F. E. Jr.*; Moiseeva, N.*; Bau, R.*; 新村 信雄

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101(31), p.11215 - 11220, 2004/08

 被引用回数:46 パーセンタイル:36.72(Multidisciplinary Sciences)

原研原子炉JRR-3設置の生体高分子用中性子回折装置BIX-3を用いて、高い熱安定性を持つ${it Pyrococcus furiosus}$由来ルブレドキシンの中性子結晶構造解析を行った。結晶化はH原子からのバックグラウンドを抑えるため重水中で行った。回折実験は常温で行い、1.5${AA}$分解能でデータ収率81.9%を得た。立体構造モデルの精密化では、306個のH原子と50個のD原子及び37個の水和水を同定した。その結果、モデルの信頼性を示す${it R}$因子及び${it R}$$$_{free}$$因子は最終的に各々18.6%, 21.7%となった。この中性子解析により、X線解析では明確でなかったアミノ酸側鎖のO-D結合の方位を明らかにできた。また、主鎖のN-H結合のH原子は多くがD原子に置換されている一方で、その中で5つのH原子は置換されずに保たれていることがわかった。これはその周囲の高い構造安定性を示す。さらに中性子散乱密度図では、このタンパク質の高い熱安定性に寄与していると考えられているND$$_{3}$$$$^{+}$$末端のその周囲に広がる水素結合ネットワークを詳細に明らかにすることができた。

論文

More rapid evaluation of biomacromolecular crystals for diffraction experiments

新井 栄揮; 茶竹 俊行; 鈴木 喜大*; 水野 洋*; 新村 信雄

Acta Crystallographica Section D, 60(6), p.1032 - 1039, 2004/06

 被引用回数:16 パーセンタイル:23.54(Biochemical Research Methods)

生体高分子の結晶品質の評価に用いられてきたパラメータ(R-merge, I/sigma, 最大分解能, mosaicity)は回折実験の条件に強く依存する。本論文ではrelative Wilson plot法の特徴について述べ、このプロットから得られるoverall B-factorが蛋白質結晶のcharacterizationに適していることを説明する。relative Wilson plotの例として、B型DNA十量体d(CCATTAATGG),DsrD蛋白質,鶏卵白リゾチームの評価結果を示す。B型DNAやDsrD蛋白質の結晶品質は、結晶化相図上の条件に強く依存することが明らかになった。一方、鶏卵白リゾチームの結晶品質は、結晶化相図上の条件にほとんど依存しないことが判明した。

論文

Hydrogen and hydration in proteins

新村 信雄; 茶竹 俊行; 栗原 和男; 前田 満

Cell Biochemistry and Biophysics, 40(3), p.351 - 369, 2004/06

 被引用回数:20 パーセンタイル:76.72

本論文は、中性子構造生物学に関するレビュー論文である。中性子回折は、タンパク質中の水素の位置を直接観察できる実験的手段である。われわれは、高分解能の生物物質用中性子回折装置(BIX-type)を原研に設置した。最大1.5オングストローム分解能で、タンパク質の結晶構造解析が可能であり、本論文では、これらの回折装置で得られたタンパク質中の水素・水和構造の興味深い結果を紹介した。

論文

Crystallization and preliminary neutron analysis of the dissimilatory sulfite reductase D (DsrD) protein from the sulfate-reducing bacterium $textit{Desulfovibrio vulgaris}$

茶竹 俊行; 水野 伸宏*; Voordown, G.*; 樋口 芳樹*; 新井 栄揮; 田中 伊知朗; 新村 信雄

Acta Crystallographica Section D, 59(Part2), p.2306 - 2309, 2003/12

 被引用回数:18 パーセンタイル:23.67(Biochemical Research Methods)

硫酸還元菌(Desulfovibrio vulgaris)由来DsrDは立体構造中にDNA結合モチーフを持つことが判明している。本研究では、DNA認識における水素結合様式及び水和構造ネットワークの解明を目的として、中性子結晶構造解析を試みている。中性子回折実験に必要な大型結晶(1mm$$^{3}$$以上)を得るために、結晶析出相図とX線回折実験による結晶化情報の検討と、マクロシーディングを行い、1.7mm$$^{3}$$の単結晶を得ることに成功した。現在、結晶1軸方向での中性子回折実験データ収集が終わり、構造解析で水素水和構造の概要が見えたので報告する。

論文

High resolution neutron protein crystallography, hydrogen and hydration in proteins

新村 信雄; 茶竹 俊行; Ostermann, A.; 栗原 和男; 田中 伊知朗

Zeitschrift f$"u$r Kristallographie, 218(2), p.96 - 107, 2003/03

これは原研で開発した中性子回折装置BIX-3を用いて行った中性子構造生物学研究の総合報告の依頼原稿である。中性子構造生物学はタンパク質の水素,水和構造を原子レベルで決定できる唯一の実験手法であり、原理はわかっており30年前に実験の試みはされたが、実験データ収集に1年以上かかるのでその後ほとんど行われてこなかった。われわれ原研グループは中性子イメージングプレート(IP)及びいくつかの技術開発を成功させ、中性子回折装置BIX-3を建設し、それにより基本的なタンパク質ミオグロビン,ルブレドキシンの水素を含む立体構造を高分解能で決定し、中性子構造生物学を確立した。それにより得られたいくつかの成果をまとめた。内容は中性子回折装置BIX-3の説明,中性子IPの説明,BIXにより決定されたミオグロビン,ルブレドキシンの水素原子の見え方,水素結合の見え方,H/D交換とその意義,水和水のダイナミックスについて紹介した。

論文

Hydration in proteins observed by high-resolution neutron crystallography

茶竹 俊行; Ostermann, A.; 栗原 和男; Parak, F.*; 新村 信雄

Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 50(3), p.516 - 523, 2003/02

蛋白質や核酸などの生体分子は三次元構築して初めてその機能を発現する。その構造構築の過程において、水素原子や水和水は重要な役割を果たしているが、これらの立体構造を決定できる方法は中性子結晶解析のみである。本研究では、三種類の蛋白質について1.5~1.6$AA $分解能での中性子結晶構造解析を行い、水和構造の詳細を明らかにすることに成功した。中性子核密度図上で水分子はさまざまな形をとっており、しかも、この形状と水分子のダイナミクスとの間に重要な相関が見いだされた。今回明らかになった水分子のダイナミクスは、コンピューターシミュレーションやNMRでの溶媒和解析の研究に対する有益な情報となることが希望される。

論文

構造生物学; X線と中性子の相補性

新村 信雄; 茶竹 俊行

波紋, 13(1), p.47 - 50, 2003/01

構造生物学におけるX線と中性子の相補性については中性子構造生物学を特徴付けるため補足的に書かれる場合が多く、記述は断片的である。ここではX線と中性子の相補性だけに焦点を絞って系統的に書いてある。まず、プローブ特性の違いからくる実験技術に関係する相違、次に、中性子がX線に比べて最も特徴的なことは、水素原子が観測しやすいことであり、X線と中性子で水素原子を観測する際の相違を個別的かつ系統的に議論してみる。最も大きな差異としては、線束の強度差と水素原子の散乱能がある。X線は中性子に比べて強度が強いので、ハイスループットでの蛋白質立体構造決定に適している。一方、中性子は強度は弱いが、水素原子を高精度で見ることが可能であるので、蛋白質の精密構造解析に適している。

論文

A High-performance neutron diffractometer for biological crystallography (BIX-3)

田中 伊知朗; 栗原 和男; 茶竹 俊行; 新村 信雄

Journal of Applied Crystallography, 35(Part1), p.34 - 40, 2002/02

生体高分子の水素原子の位置を決定するために、生体高分子結晶構造解析用高性能中性子回折計(BIX-3)が日本原子力研究所(JAERI)JRR-3Mに建設された。これには、中性子イメージングプレートや筆者らが開発した弾性湾曲シリコンモノクロメータなどのいくつかの最新の革新的技術が採用されている。これらのおかげでこの回折計はコンパクトな垂直型配置が可能となった。タンパク質のミオグロビンやルブレドキシンからのデータ収集は約1ヶ月で、高精度に水素原子位置を同定できる1.5Å分解能のデータであった。ブラッグ反射強度を測定するために結晶ステップ走査法を採用することにより、シグナル・ノイズ比はラウエ法と比較して大変良好だった。これはBIX-3が現在、世界のタンパク質用の中性子結晶構造解析装置のなかで最良の装置の一つであることを示している。

論文

Crystallization of a large single crystal of a B-DNA decamer for a neutron diffraction experiment by the phase-diagram technique

新井 栄揮; 茶竹 俊行; 峯崎 善章*; 新村 信雄

Acta Crystallographica Section D, 58(Part 1), p.151 - 153, 2002/01

 被引用回数:23 パーセンタイル:16.98(Biochemical Research Methods)

B型DNA+量体d(CCATTAATGG)を用い、結晶化の相図を作製することにより、中性子結晶回折実験に適した巨大単結晶を得ることに成功した。30%(v/v)のMPD(2-methyl-2,4-pentandiol)存在下において作製したDNAとMgCl濃度に関する相図では、MgCl$$_{2}$$が~100mM近傍でDNAの溶解度が最小になることが判明した。この溶解度最小付近の溶液条件で得たDNA結晶は1.7$$times$$1.3$$times$$0.6mmの体積を有し、中性子回折実験に十分適していることが判明した。

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