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A Technique for determining the deuterium/hydrogen contrast map in neutron macromolecular crystallography

茶竹 俊行*; 藤原 悟

Acta Crystallographica Section D; Structural Biology (Internet), 72(1), p.71 - 82, 2016/01

 被引用回数:3 パーセンタイル:64.72(Biochemical Research Methods)

A technique for the determination of the deuterium/hydrogen (D/H) contrast map in neutron macromolecular crystallography has been developed and evaluated using ribonuclease A. In this technique, the contrast map between the D$$_{2}$$O-solvent and H$$_{2}$$O-solvent crystals is calculated using subtraction in real space. The present technique can thus utilize all the amplitudes of the neutron structure factors for both of the D$$_{2}$$O-solvent and H$$_{2}$$O solvent crystals. The neutron D/H contrast maps clearly demonstrate powerful detectability of the H/D exchange in proteins. In fact, alternative protonation states and alternative conformations of hydroxyl groups are observed at a medium resolution (1.8 AA ). Moreover, water molecules can be categorized into three types according to their tendency for rotational disorder. These results directly indicate improvement in the neutron crystal structure analysis. Combination of this technique with the conventional neutron structure determination protocols thus makes more precise and efficient determination of the D atom positions in proteins possible.


Direct interactions between Z-DNA and alkaline earth cations, discovered in the presence of high concentrations of MgCl$$_{2}$$ and CaCl$$_{2}$$

茶竹 俊行*; 角南 智子

Journal of Inorganic Biochemistry, 124, p.15 - 25, 2013/07

 被引用回数:10 パーセンタイル:48.82(Biochemistry & Molecular Biology)

In this study, crystals of Z-DNA hexamer d(CGCGCG) complexed with MgCl$$_{2}$$ and CaCl$$_{2}$$ were obtained in the presence of high concentrations of alkaline earth salts (500 mM) using a temperature control technique, and their crystal structures were determined at 1.3${AA}$ resolution. Mg$$^{2+}$$ and Ca$$^{2+}$$ cations in these structures tend to interact directly with phosphate groups of Z-DNA duplexes; however, they tend to form water-mediated interactions with Z-DNA in the presence of lower concentrations of alkaline earth salts. In these crystals, a DNA duplex was laid along its c-axis and interacted with its 6 neighboring DNA duplexes through coordination bonds of P-O...(Mg$$^{2+}$$ or Ca$$^{2+}$$)...O-P. A symmetrical hexagonal Z-DNA duplex assembly model may explain DNA condensation caused by alkaline earth salts. These structures offer insights into the functions of alkaline earth cations essential to the structures and assembly of Z-DNA duplexes.


An Approach to DNA crystallization using the thermal reversible process of DNA duplexes

茶竹 俊行*; 佐崎 元*; 亀甲 龍彦*; 藤原 悟; 石川 卓哉*; 松本 治*; 森本 幸生*

Crystal Growth & Design, 10(3), p.1090 - 1095, 2010/03

 被引用回数:4 パーセンタイル:48.86(Chemistry, Multidisciplinary)



Functional aberration of myofibrils by cardiomyopathy-causing mutations in the coiled-coil region of the troponin-core domain

松本 富美子; 前田 佳代*; 茶竹 俊行*; 前田 雄一郎*; 藤原 悟

Biochemical and Biophysical Research Communications, 382(1), p.205 - 209, 2009/04

 被引用回数:13 パーセンタイル:61.86(Biochemistry & Molecular Biology)

心筋症発症に関連する筋収縮調節蛋白質トロポニンT(TnT)の2種類の変異体(E244D, K247R)の変異部位は、Tn-コア領域のコイルドコイル領域に存在する。この領域の変異がTnの調節機構に及ぼす影響を明らかにするために、TnTのこの部位でのさまざまな変異体を含む筋原繊維のカルシウム依存性ATP分解活性を測定した。その結果、疾病関連変異体E244Dは、カルシウム感受性を変化させずに最大ATP分解活性を増大させることを確認するとともに、変異体K247Rも同様の効果を持つことを初めて明らかにした。さらにさまざまな変異体(E244D, E244M, E244A, E244K, K247R, K247E, and K247A)は、カルシウム感受性の変化はないが、最大ATP分解活性についてさまざまな影響を与えることが明らかとなった。これらの変異体を含むTnコアの分子動力学計算の結果、変異部位付近の水素結合ネットワークがTnの機能発現に重要であることが示唆された。


A Neutron crystallographic analysis of a cubic porcine insulin at pD 6.6

石川 卓哉*; 茶竹 俊行*; 大西 裕季*; 田中 伊知朗*; 栗原 和男; 黒木 良太; 新村 信雄*

Chemical Physics, 345(2-3), p.152 - 158, 2008/04

 被引用回数:12 パーセンタイル:56.54(Chemistry, Physical)

A neutron diffraction study has been carried out at 2.7 ${AA}$ resolution on cubic porcine insulin at pD 6.6 using the BIX-4 at the JRR-3 reactor of JAEA. The ionization states of several amino acids in porcine insulin have been obtained at pD 6.6 and they are compared with those at pD 9 obtained by neutron diffraction as well as those at pH 6.50 and 6.98 obtained by X-ray diffraction. For the present work, a large single crystal of 2.7 mm$$^{3}$$ was obtained by dialysis. Refinement of the structure was carried out and the ${it R}$-factor was 21.4% with the free ${it R}$ being 29.4%. Protonation and deprotonation of various ionizable amino acid residues were observed and discussed on the basis of the charged states estimated by the ${it pK$_{a}$}$ values. In the case of His${it B}$5, both N$$pi$$ and N$$tau$$ of an imidazole ring are protonated at pD 6.6, but at pD 9 only N$$pi$$ is protonated. In contrast, for His${it B}$10, both N$$pi$$ and N$$tau$$ are protonated at pD 6.6 as well as at pD 9.


Protonation states of buried histidine residues in human deoxyhemoglobin revealed by neutron crystallography

茶竹 俊行*; 柴山 修哉*; Park, S. Y.*; 栗原 和男; 玉田 太郎; 田中 伊知朗*; 新村 信雄*; 黒木 良太; 森本 幸生*

Journal of the American Chemical Society, 129(48), p.14840 - 14841, 2007/12

 被引用回数:22 パーセンタイル:39.85(Chemistry, Multidisciplinary)

A large crystal of human deoxy hemoglobin (Hb) was grown from D$$_{2}$$O solution (pD 6.3). The preliminary neutron diffraction experiment was carried out at the KUR reactor in RRI of Kyoto University, and the diffraction data set to 2.1 ${AA}$ resolution was collected at JRR-3 reactor in JAEA using the BIX-3. The neutron crystal structure of Hb reveals that both the $$alpha$$- and $$beta$$-distal histidines (His$$alpha$$58 and His$$beta$$63) adopt fully (doubly) protonated form. This finding sharply contrasts with existing results on R (relaxed) state liganded Hbs where such full protonation can never occur. This results suggest an interesting possibility that the both histidines could contribute to the T (tense) state Bohr effect of Hb. Indeed, the protonation/deprotonation of each distal histidine may have a direct impact on the oxygen affinity of the nearby heme group through sterical hindrance and/or polarity change in the heme pocket without affecting the allosteric equilibrium of Hb.



新井 栄揮; 茶竹 俊行*; 新村 信雄

日本結晶学会誌, 48(2), p.133 - 139, 2006/04

本研究ではB型DNA+量体d(CCATTAATGG)$$_{2}$$について、X線及び中性子結晶構造解析を行い、多くの水和水について水素原子位置を含めて決定することに成功した。DNA二重らせん周辺の水和パターンは、核酸の構造と機能に重要な役割を果たすと考えられている。特に、AT塩基対が連なる領域のMinor groove(副溝)内には、六角形状の水和パターンが存在することが知られていた。しかし、それはX線結晶回折によって明らかにされた水分子の酸素原子位置から予想されたものであった。今回、水和水の水素原子位置が決定できたことにより、水分子の配向を含めた詳細な水和水ネットワークの様子が明らかになった。これにより、水和パターンは単純な六角形だけでは表せず、これまでの予想よりも数多くの水素結合がDNA鎖-水分子間に存在することが明らかになった。


Recent results on hydrogen and hydration in biology studied by neutron macromolecular crystallography

新村 信雄; 新井 栄揮; 栗原 和男; 茶竹 俊行*; 田中 伊知朗*; Bau, R.*

Cellular and Molecular Life Sciences, 63(3), p.285 - 300, 2006/02

 被引用回数:39 パーセンタイル:60.89(Biochemistry & Molecular Biology)



Complicated water orientations in the minor groove of the B-DNA decamer d(CCATTAATGG)$$_{2}$$ observed by neutron diffraction measurements

新井 栄揮; 茶竹 俊行*; 大原 高志; 栗原 和男; 田中 伊知朗*; 鈴木 喜大*; 藤本 瑞*; 水野 洋*; 新村 信雄

Nucleic Acids Research, 33(9), p.3017 - 3024, 2005/05

 被引用回数:87 パーセンタイル:15.72(Biochemistry & Molecular Biology)

本研究ではB型DNA十量体d(CCATTAATGG)$$_{2}$$について、X線及び中性子結晶構造解析を行い、多くの水和水について水素原子位置を含めて決定することに成功した。DNA二重らせん周辺の水和パターンは、核酸の構造と機能に重要な役割を果たすと考えられている。特に、AT塩基対が連なる領域のMinor groove(副溝)内には、六角形状の水和パターンが存在することが知られていた。しかし、それはX線結晶回折によって明らかにされた水分子の酸素原子位置から予想されたものであった。今回、水和水の水素原子位置が決定できたことにより、水分子の配向を含めた詳細な水和水ネットワークの様子が明らかになった。これにより、水和パターンは単純な六角形だけでは表せず、これまでの予想よりも数多くの水素結合がDNA鎖-水分子間に存在することが明らかになった。


Hydrogen and hydration in proteins and nucleic acids; Neutron diffraction from bio-macromolecules at JAERI

新村 信雄; 新井 栄揮; 栗原 和男; 茶竹 俊行*; 田中 伊知朗*; Bau, R.*

Hydrogen- and Hydration-Sensitive Structural Biology, p.17 - 35, 2005/00



A Neutron crystallographic analysis of a rubredoxin mutant at 1.6 ${AA}$ resolution

茶竹 俊行*; 栗原 和男; 田中 伊知朗*; Tsyba, I.*; Bau, R.*; Jenney, F. E. Jr.*; Adams, M. W. W.*; 新村 信雄

Acta Crystallographica Section D, 60(8), p.1364 - 1373, 2004/08

 被引用回数:30 パーセンタイル:11.54(Biochemical Research Methods)

${it Pyrococcus furiosus}$由来ルブレドキシンの高い熱安定性の起源を明らかにするため、その変異型に対する1.6${AA}$分解能中性子結晶構造解析(重水中で結晶育成)を生体高分子用中性子回折装置BIX-3(原研原子炉JRR-3内設置)を用いて行った。${it P. furiosus}$由来ルブレドキシンは、通常の熱安定性を持つ常温菌由来のルブレドキシンと異なるアミノ酸残基部分を持つ。そこで、その中で重要と考えられる3つの残基を常温菌のものに変えた変異型を発現させ、その水素結合パターンを変異の無い野生型と比較した。その結果、変異を行った残基の一つで水素結合パターンの違いが明らかになった。これをもとに熱安定性の議論を行った。一方で、このタンパク質の水素/重水素置換率の詳細も調べた。その結果、ルブレドキシンの鉄-硫黄中心(酸化還元機能を司る)にかかわる4つのシステイン残基周辺は、最も水素/重水素置換が進んでいないということがわかった。これはこの周囲の構造が安定であることを示唆している。加えて、この高分解能な中性子構造解析により、水和水の秩序性も含めた詳細な水和構造が明らかになった。


Neutron crystallographic study on rubredoxin from ${it Pyrococcus furiosus}$ by BIX-3, a single-crystal diffractometer for biomacromolecules

栗原 和男; 田中 伊知朗*; 茶竹 俊行*; Adams, M. W. W.*; Jenney, F. E. Jr.*; Moiseeva, N.*; Bau, R.*; 新村 信雄

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101(31), p.11215 - 11220, 2004/08

 被引用回数:46 パーセンタイル:36.72(Multidisciplinary Sciences)

原研原子炉JRR-3設置の生体高分子用中性子回折装置BIX-3を用いて、高い熱安定性を持つ${it Pyrococcus furiosus}$由来ルブレドキシンの中性子結晶構造解析を行った。結晶化はH原子からのバックグラウンドを抑えるため重水中で行った。回折実験は常温で行い、1.5${AA}$分解能でデータ収率81.9%を得た。立体構造モデルの精密化では、306個のH原子と50個のD原子及び37個の水和水を同定した。その結果、モデルの信頼性を示す${it R}$因子及び${it R}$$$_{free}$$因子は最終的に各々18.6%, 21.7%となった。この中性子解析により、X線解析では明確でなかったアミノ酸側鎖のO-D結合の方位を明らかにできた。また、主鎖のN-H結合のH原子は多くがD原子に置換されている一方で、その中で5つのH原子は置換されずに保たれていることがわかった。これはその周囲の高い構造安定性を示す。さらに中性子散乱密度図では、このタンパク質の高い熱安定性に寄与していると考えられているND$$_{3}$$$$^{+}$$末端のその周囲に広がる水素結合ネットワークを詳細に明らかにすることができた。


More rapid evaluation of biomacromolecular crystals for diffraction experiments

新井 栄揮; 茶竹 俊行; 鈴木 喜大*; 水野 洋*; 新村 信雄

Acta Crystallographica Section D, 60(6), p.1032 - 1039, 2004/06

 被引用回数:16 パーセンタイル:23.54(Biochemical Research Methods)

生体高分子の結晶品質の評価に用いられてきたパラメータ(R-merge, I/sigma, 最大分解能, mosaicity)は回折実験の条件に強く依存する。本論文ではrelative Wilson plot法の特徴について述べ、このプロットから得られるoverall B-factorが蛋白質結晶のcharacterizationに適していることを説明する。relative Wilson plotの例として、B型DNA十量体d(CCATTAATGG),DsrD蛋白質,鶏卵白リゾチームの評価結果を示す。B型DNAやDsrD蛋白質の結晶品質は、結晶化相図上の条件に強く依存することが明らかになった。一方、鶏卵白リゾチームの結晶品質は、結晶化相図上の条件にほとんど依存しないことが判明した。


Hydrogen and hydration in proteins

新村 信雄; 茶竹 俊行; 栗原 和男; 前田 満

Cell Biochemistry and Biophysics, 40(3), p.351 - 369, 2004/06

 被引用回数:20 パーセンタイル:76.72



Crystallization and preliminary neutron analysis of the dissimilatory sulfite reductase D (DsrD) protein from the sulfate-reducing bacterium $textit{Desulfovibrio vulgaris}$

茶竹 俊行; 水野 伸宏*; Voordown, G.*; 樋口 芳樹*; 新井 栄揮; 田中 伊知朗; 新村 信雄

Acta Crystallographica Section D, 59(Part2), p.2306 - 2309, 2003/12

 被引用回数:18 パーセンタイル:23.67(Biochemical Research Methods)

硫酸還元菌(Desulfovibrio vulgaris)由来DsrDは立体構造中にDNA結合モチーフを持つことが判明している。本研究では、DNA認識における水素結合様式及び水和構造ネットワークの解明を目的として、中性子結晶構造解析を試みている。中性子回折実験に必要な大型結晶(1mm$$^{3}$$以上)を得るために、結晶析出相図とX線回折実験による結晶化情報の検討と、マクロシーディングを行い、1.7mm$$^{3}$$の単結晶を得ることに成功した。現在、結晶1軸方向での中性子回折実験データ収集が終わり、構造解析で水素水和構造の概要が見えたので報告する。


High resolution neutron protein crystallography, hydrogen and hydration in proteins

新村 信雄; 茶竹 俊行; Ostermann, A.; 栗原 和男; 田中 伊知朗

Zeitschrift f$"u$r Kristallographie, 218(2), p.96 - 107, 2003/03



Hydration in proteins observed by high-resolution neutron crystallography

茶竹 俊行; Ostermann, A.; 栗原 和男; Parak, F.*; 新村 信雄

Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 50(3), p.516 - 523, 2003/02

蛋白質や核酸などの生体分子は三次元構築して初めてその機能を発現する。その構造構築の過程において、水素原子や水和水は重要な役割を果たしているが、これらの立体構造を決定できる方法は中性子結晶解析のみである。本研究では、三種類の蛋白質について1.5~1.6$AA $分解能での中性子結晶構造解析を行い、水和構造の詳細を明らかにすることに成功した。中性子核密度図上で水分子はさまざまな形をとっており、しかも、この形状と水分子のダイナミクスとの間に重要な相関が見いだされた。今回明らかになった水分子のダイナミクスは、コンピューターシミュレーションやNMRでの溶媒和解析の研究に対する有益な情報となることが希望される。


構造生物学; X線と中性子の相補性

新村 信雄; 茶竹 俊行

波紋, 13(1), p.47 - 50, 2003/01



A High-performance neutron diffractometer for biological crystallography (BIX-3)

田中 伊知朗; 栗原 和男; 茶竹 俊行; 新村 信雄

Journal of Applied Crystallography, 35(Part1), p.34 - 40, 2002/02



Crystallization of a large single crystal of a B-DNA decamer for a neutron diffraction experiment by the phase-diagram technique

新井 栄揮; 茶竹 俊行; 峯崎 善章*; 新村 信雄

Acta Crystallographica Section D, 58(Part 1), p.151 - 153, 2002/01

 被引用回数:23 パーセンタイル:16.98(Biochemical Research Methods)


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