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論文

Live-cell imaging study of mitochondrial morphology in mammalian cells exposed to X-rays

野口 実穂; 嘉成 由紀子; 横谷 明徳; 成田 あゆみ; 藤井 健太郎

Radiation Protection Dosimetry, 166(1-4), p.101 - 103, 2015/09

 パーセンタイル:100(Environmental Sciences)

It is well known that radiosensitivity of cells is dependent on cell cycle phases. In general, cells are most radiosensitive in M phase and most resistant in late S phase. Cell cycle-dependent radiosensitivity seems to be involved in DSB repair ability which is varied in each cell cycle. Maeda et al. reported that radiation induced cell death depends on not only DSB induction and its repair in a cell nucleus but also damaging cytoplasm, suggesting that cytoplasm may play an important role in the radiobiological responses. Mitochondria, a kind of major organelles, are distributed throughout cytoplasm. They are continuously fusing or dividing. Mitochondrial morphology is also known to change dynamically depending on cell cycle. In this study, to investigate whether mitochondrial morphology relates to cell cycle-dependent radiosensitivity, we analyzed kinetics of mitochondrial morphology after irradiation of X-rays. Fragmented mitochondria were found to accumulate in proliferating cells irradiated with X-rays. Cell population with fragmented mitochondria increased with time after irradiation. When cells irradiated in M phase, cell population with fragmented mitochondria also increased with time after irradiation. These results suggest that the changes of mitochondrial morphology are not significantly related to the cell cycle phase at which the cells are irradiated, and might have little association with cell cycle-dependent radiosensitivity.

論文

Visualisation of cell cycle modifications by X-ray irradiation of single HeLa cells using fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicators

神長 輝一; 野口 実穂; 成田 あゆみ; 坂本 由佳; 嘉成 由紀子; 横谷 明徳

Radiation Protection Dosimetry, 166(1-4), p.91 - 94, 2015/09

 被引用回数:3 パーセンタイル:53.75(Environmental Sciences)

To explore radiation effects on the mammalian cell cycle, it would be essential to trace single cells as live cell images observed by a time-lapse imaging technique. HeLa-FUCCI cells are one of useful model cell lines to visualize cell cycle because their nucleus show different colors. We irradiated the cells with X-rays of 5 Gy. The cells were incubated for 48 hr in a small incubator set on a fluorescent microscope to track about 40 cells. Most of the irradiated cells underwent cell division at M phase, and then progressed into G1 phase. However, about a half of the cell population showed a significantly longer period toward cell division, indicating that G2 phase was prolonged (G2 arrest) by irradiation. The elongation of G2 phase was more prominent for irradiation to cells in S/G2 phase than those in G1 phase. The observed cell cycle modification suggests that G2/M checkpoint system control the cycle to ensure repairing DNA damage.

論文

Real-time observation of irradiated HeLa-cell modified by fluorescent ubiquitination-based cell-cycle indicator using synchrotron X-ray microbeam

成田 あゆみ; 神長 輝一; 横谷 明徳; 野口 実穂; 小林 克己*; 宇佐美 徳子*; 藤井 健太郎

Radiation Protection Dosimetry, 166(1-4), p.192 - 196, 2015/09

 被引用回数:2 パーセンタイル:66.76(Environmental Sciences)

動物培養細胞の細胞周期に依存した放射線照射影響に関する知見は、そのほとんどが照射された細胞集団を統計学的手法により解析したものである。本研究は、照射された細胞一つを顕微鏡下で直接追跡することにより、刻々と変化する照射細胞の挙動をリアルタイムで観察する手法を確立することを目的とした。照射細胞には細胞周期が判別できるFUCCI(Fluorescent Ubiquitination-based Cell CycleIndicator)発現HeLa細胞(ヒトがん細胞)を用いた。また、照射には細胞一つ分まで大きさが調整できる放射光X線マイクロビームを利用した。さらに照射した細胞を長時間観察するために、細胞を培養しながら観察可能なタイムラプス顕微鏡を立ち上げ、照射した個々の細胞の分裂の様子を追跡した。その結果、G1期で照射した細胞では周期の遅延が認められなかった。それに対してS/G2期にある細胞に照射を行ったところ、明確な周期遅延が観察された。以上から、顕微鏡下での長時間観察によって、放射線照射された細胞への影響をリアルタイムで観察することができた。

論文

Live-cell imaging study of mitochondrial morphology in mammalian cells irradiated

嘉成 由紀子; 野口 実穂; 神長 輝一; 坂本 由佳; 横谷 明徳

Journal of Radiation Research, 55(Suppl.1), p.i129 - i130, 2014/03

In this study, we report a new approach of tracing the mitochondrial morphological change of the cells exposed to high LET radiation using a live-cell imaging technique. We used the NMuMG (Normal murine mammary gland)-FUCCI2 cell line. Using the FUCCI2 expressing cells, we can observe red fluorescence in the nuclei of G1 phase cells and green fluorescence in the nuclei of S/G2/M phase cells. We labeled mitochondria by Mitotracker Red. Kinetics of mitochondrial morphology was analyzed by the live-cell imaging technique using a fluorescence microscope. Mitochondrial images were captured for 4 days after irradiation. In a preliminary study, we found that X-ray irradiation of cells caused mitochondrial fragmentation, and proportion of cell population with fragmented mitochondria increased with increasing dose and with time after irradiation. It is demonstrated that the method proposed in this study works successively to trace cytoplasmic effects by high LET irradiation.

論文

Visualization of cell-cycle modification by ionizing irradiation in single HeLa cells using fluorescent ubiquitination-based cell-cycle indicator

神長 輝一; 坂本 由佳; 嘉成 由紀子; 野口 実穂; 横谷 明徳

Journal of Radiation Research, 55(Suppl.1), p.i127 - i128, 2014/03

Fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator (FUCCI) HeLa cells are one of useful model cell lines to visualize a cell-cycle because their nuclei show different colors; orange indicating G1; green indicating S/G2. In order to establish a novel assay system to study cell-cycle modification by high LET irradiation such as ion beams for cancer therapy we have observed time-lapse images of HeLa-FUCCI cells irradiated as a preliminary experiment using conventional X-rays instead of high LET ion beams. The cell-cycle was strongly arrested by irradiation at S/G2 and never progressed to G1. In contrast, cells irradiated at G1 progress to S/G2 with a similar time course as non-irradiated control cells. These results show that single FUCCI cell exposure and live cell imaging are a powerful method to trace the single cell effect of high LET irradiation on the cell-cycle in future.

論文

Three-dimensional culture of HeLa-FUCCI cells for study of bystander cell cycle effect of high LET particles

坂本 由佳; 神長 輝一; 嘉成 由紀子; 野口 実穂; 横谷 明徳

Journal of Radiation Research, 55(Suppl.1), p.i120 - i121, 2014/03

In order to examine bystander effects in the 3D cell system, we have developed a FUCCI-HeLa spheroid system. FUCCI (Fluorescent Ubiquitination-based Cell Cycle Indicator) cells show specific colors of cell nuclei depending on a cell cycle. Thus we can easily trace cell cycle modifications by irradiation. We observed bystander cell-cycle delay as preliminary tests using monolayer culture of the HeLa-FUCCI cells. It will be very interesting to examine whether the cell-cycle effect also appears in the 3D cell system exposed to single high LET particles. We have determined suitable conditions for the spheroid culture, such as size of spheroids and methods of stable fixing a spheroid in a dish to perform the microbeam irradiation, and observation of the cell cycles of each cell in a spheroid after irradiation using a time-lapse micro-imaging technique.

論文

Significance of DNA Polymerase I in ${it in vivo}$ processing of clustered DNA damage

鹿園 直哉; 赤松 憲; 高橋 桃子*; 野口 実穂; 漆原 あゆみ; O'Neill, P.*; 横谷 明徳

Mutation Research; Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 749(1-2), p.9 - 15, 2013/09

 被引用回数:8 パーセンタイル:58.73(Biotechnology & Applied Microbiology)

クラスターDNA損傷は、電離放射線によってDNAへリックス二回転中に二つ以上の損傷が生じるものである。クラスターDNA損傷がどの程度、また、どのように生物影響を及ぼすのかに関しては不明な点が多い。本研究では、鎖切断と脱塩基部位や8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG)を含むクラスターDNA損傷を用い、大腸菌に形質転換し、形質転換効率及び突然変異頻度を調べた。鎖切断と脱塩基部位からなるクラスターDNA損傷の場合、鎖切断及び脱塩基部位がそれぞれ単独であった場合に対し、形質転換効率は大幅に低下することが明らかになった。損傷間の距離を離す(10-20bp)と、形質転換効率はDNA polymerase I(Pol I)の作用により回復した。一方、鎖切断と8-oxoGからなるクラスターDNA損傷の場合、クラスターDNA損傷による突然変異頻度はPol Iの働きによって低下することが明らかとなった。これらの結果は、クラスターDNA損傷による生物効果にPol Iが深く関与することを示している。

論文

Evaluation of SCCVII tumor cell survival in clamped and non-clamped solid tumors exposed to carbon-ion beams in comparison to X-rays

平山 亮一*; 鵜澤 玲子*; 高瀬 信宏*; 松本 孔貴*; 野口 実穂; 幸田 華奈*; 尾崎 匡邦*; 山下 慶*; Li, H.*; 加瀬 優紀*; et al.

Mutation Research; Genetic Toxicology And Environmental Mutagenesis, 756(1-2), p.146 - 151, 2013/08

 被引用回数:12 パーセンタイル:44.64(Biotechnology & Applied Microbiology)

The aim of this study was to measure the RBE (relative biological effectiveness) and OER (oxygen enhancement ratio) for survival of cells within implanted solid tumors following exposure to 290 MeV/nucleon carbon-ion beams or X-rays. Squamous cell carcinoma cells (SCCVII) were transplanted into the right hindlegs of syngeneic C3H male mice. Irradiation with either carbon-ion beams with a 6-cm spread-out Bragg peak (SOBP, at 46 and 80 keV/$$mu$$m) or X-rays was delivered to 5-mm or less diameter tumors. We defined three different oxygen statuses of the irradiated cells. Hypoxic and normoxic conditions in tumors were produced by clamping or not clamping the leg to avoid blood flow. The RBE values increased with increasing LET in SOBP beams. The OER values of carbon-ion irradiated samples were small in comparison to those of X-ray irradiated samples. However, no significant changes of the OER at proximal and distal positions within the SOBP carbon-ion beams were observed. To conclude, we found that the RBE values for cell survival increased with increasing LET and that the OER values changed little with increasing LET within the SOBP carbon-ion beams.

論文

The Mutagenic potential of 8-oxoG/single strand break-containing clusters depends on their relative positions

野口 実穂; 漆原 あゆみ; 横谷 明徳; O'Neill, P.*; 鹿園 直哉

Mutation Research; Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 732(1-2), p.34 - 42, 2012/04

 被引用回数:11 パーセンタイル:52.3(Biotechnology & Applied Microbiology)

In vivoにおいて塩基損傷を伴った鎖切断の効果はいまだ多くが不明である。本研究においてわれわれは1ヌクレオチドgap(GAP)と8-oxoGから成るクラスターDNA損傷の突然変異誘発性について明らかにした。MutY欠損株において、GAPと8-oxoGの2つの損傷から成り、これらが相補鎖にまたがって存在するクラスター損傷の変異頻度は8-oxoGとAPサイトから成るクラスター損傷とほぼ同じ値を示したことから、クラスター損傷内において、GAPはAPサイトと同様に処理されることが示唆された。GAPと8-oxoGが同一鎖上に存在するクラスター損傷の変異頻度は8-oxoG単独損傷とほぼ等しい値であった。3つの損傷から成るクラスター損傷(GAPと8-oxoGが相補鎖、その同一鎖上にもう一つの8-oxoG)の変異頻度は8-oxoG単独損傷より高い値であったが、2つの8-oxoGが相補鎖にまたがって存在するクラスター損傷に比べて低い値であった。これらの結果から、クラスター損傷内にGAPが存在する場合、存在しない場合に比べて、8-oxoGの鋳型として向いに挿入されるヌクレオチドの変異誘発性が低くなることが示唆された。さらに、GAPの修復は相補鎖の8-oxoGにより阻害されるが、同一鎖の8-oxoGには阻害されないことが示唆され、GAPの修復が生物影響に大きく影響を与えることが示された。

論文

A Novel technique using DNA denatureation to detect multiplly induced single-strand breaks in a hydrated plasmid DNA molecule by X-ray and $$^{4}$$He$$^{2+}$$ ion irradiation

横谷 明徳; 鹿園 直哉; 藤井 健太郎; 野口 実穂; 漆原 あゆみ

Radiation Protection Dosimetry, 143(2-4), p.219 - 225, 2011/02

 被引用回数:3 パーセンタイル:66.23(Environmental Sciences)

高LET放射線によりDNA上に多重1本鎖切断(m-SSBs)が生じることが予測されているが、これまでのプラスミドDNAをモデル分子として用いる手法ではその収率を過小評価してしまう可能性がある。なぜなら複数のSSBがDNAの同一鎖上あるいは2本鎖切断(DSB)にはならない程度離れた反対鎖上に生じた場合はこれを検出することができないためである。われわれはDNA変性を利用した新しいm-SSBsの検出法を開発してきた。この方法では、m-SSBsは1本鎖DNAの分子量変化として電気泳動法により定量される。今回X線及びHe$$^{2+}$$イオンビームが照射された水和pUC18プラスミドDNA中に生じたm-SSBsを定量した。得られた結果は、実験の分解能の範囲内で($$<$$140塩基)1本鎖DNAの半分は無傷で残っているというものであった。これは当初の予想に反し、高LET放射線照射であってもm-SSBs損傷は140塩基対を超えた領域には広がらないことを示唆している。

論文

A Model for analysis of the yield and the level of clustering of radiation-induced DNA-strand breaks in hydrated plasmids

鹿園 直哉; 横谷 明徳; 漆原 あゆみ; 野口 実穂; 藤井 健太郎

Radiation Protection Dosimetry, 143(2-4), p.181 - 185, 2011/02

 被引用回数:2 パーセンタイル:75.97(Environmental Sciences)

Although it is widely accepted that the spatial distribution of strand breaks is highly relevant to the biological consequences of radiation, the extent to which strand breaks are clustered is not usually demonstrated directly from experimental data. To evaluate the spatial distribution of radiation-induced strand breaks, we have developed a model for the generation of strand breaks after irradiation. To find out whether the model is valid, we compared the calculated values to experimental data obtained by a plasmid DNA assay. Taking into account the inherent bias of the plasmid assay, the model described well the experimental results of hydrated plasmids exposed to radiation.

論文

Induction of DNA DSB and its rejoining in clamped and non-clamped tumours after exposure to carbon ion beams in comparison to X-rays

平山 亮一*; 鵜沢 玲子*; 松本 孔貴*; 野口 実穂; 加瀬 優紀*; 高瀬 信宏*; 伊藤 敦*; 小池 幸子*; 安藤 興一*; 岡安 隆一*; et al.

Radiation Protection Dosimetry, 143(2-4), p.508 - 512, 2011/02

 被引用回数:9 パーセンタイル:30.67(Environmental Sciences)

マウスの足に移植した腫瘍の上部をクランプした、又はクランプしない状態で80keV/$$mu$$mの炭素線、及びX線を照射したときのDSBの誘導、及び再結合について調べた。腫瘍のDSB生成量は定電圧電気泳動法により測定した。X線照射後のDSBのOERは1.68$$pm$$0.31で、この値は照射1時間後での変化は見られなかった(1.40$$pm$$0.26)。In situにおいて、酸素存在下でのこれらの損傷は1時間で60から70%が再結合した。炭素線とX線照射下において、DSBの誘発及び再結合の割合に違いは見られなかった。ゆえに、炭素線照射後のOER値及び再結合率はX線照射後と同じであり、炭素線のRBEは酸素存在下で1に近い値となった。In vivoにおけるDSBの収量は照射線量,酸素の状況,再結合時間に依存し、放射線の種類には依存しないと考えられる。

論文

Enhanced radiation-induced cell killing by Herbimycin A pre-treatment

野口 実穂; 平山 亮一*; Druzhinin, S.*; 岡安 隆一*

Radiation Physics and Chemistry, 78(12), p.1184 - 1187, 2009/12

 被引用回数:4 パーセンタイル:62.73(Chemistry, Physical)

ハービマイシンAはゲルダナマシンと同様Hsp90に結合し、Hsp90のシャペロン機能を阻害する薬剤である。Hsp90は自身のシャペロン活性により他のタンパク質の安定化を維持する働きをもち、癌細胞の成長や生存に重要な役割を果たしている。放射線照射に応答するタンパク質もHsp90により機能的に安定化されていることが知られている。そこで、本研究ではハービマイシンAが癌細胞の放射線感受性に影響を与えるかどうか、さらに放射線感受性の増強に関与する細胞内メカニズムを明らかにするため、実験を行った。特に放射線感受性のメカニズムとして、放射線誘発細胞死の主原因であるDNA二本鎖切断(DSB)とその修復について調べた。コロニー形成法により求めた生存率から、ハービマイシンAは癌細胞の放射線感受性を増強することが明らかになった。また、定電圧電気泳動法によりDSBの修復の経時的変化を調べたところ、ハービマイシンAを照射前に加えたほうが、DSBの修復効率が低下することが明らかになった。以上の結果から、ハービマイシンAは放射線誘発DSBの修復を阻害し、放射線感受性の増強を引き起こすことがわかった。ハービマイシンAと放射線併用は癌治療の新しい治療法として非常に有効であることが示された。

論文

Radioprotection by DMSO in nitrogen-saturated mammalian cells exposed to helium ion beams

平山 亮一*; 松本 孔貴*; 加瀬 優紀*; 野口 実穂; 安藤 興一*; 伊藤 敦*; 岡安 隆一*; 古澤 佳也*

Radiation Physics and Chemistry, 78(12), p.1175 - 1178, 2009/12

 被引用回数:8 パーセンタイル:41.28(Chemistry, Physical)

低酸素下での粒子線照射によって生じるOHラジカルが介在する間接効果の寄与をラジカルスカベンジャーを用いて測定した。DMSO存在下、及び非存在下で、V79細胞に150MeV/nucleonのヘリウムイオンビームをLET2.2KeV/mmで照射し、コロニー形成法により生存率を決定した。低酸素下による細胞死への間接効果の寄与は約52%であった。われわれは低酸素下においてOHラジカルの介在する間接効果は全効果のおおよそ半分になると結論づけた。

論文

Contributions of direct and indirect actions in cell killing by high-LET radiations

平山 亮一*; 伊藤 敦*; 冨田 雅典*; 塚田 照代*; 谷田貝 文夫*; 野口 実穂; 松本 孔貴*; 加瀬 優紀*; 安藤 興一*; 岡安 隆一*; et al.

Radiation Research, 171(2), p.212 - 218, 2009/02

 被引用回数:66 パーセンタイル:7.46(Biology)

放射線の生物効果はDNAの損傷を起源とする。X線と同様、重粒子線のDNA損傷も直接作用と間接作用のコンビネーションにより作られる。細胞死への間接作用の寄与はDMSOを用いた防護寄与率の最大値から算出することができる。対数増殖期のチャイニーズハムスターV79細胞に対し、DMSO存在下、及び非存在下で20から2106keV/$$mu$$mの高LET放射線を照射し、コロニー形成法により生存率を決定した。間接作用の寄与率は放射線のLETの増加に伴い減少した。しかし、寄与率は超高LET領域でも0にはならず、2106keV/$$mu$$mで32%と概算された。それゆえに、OHラジカルの放射線化学収量のG値は1000keV/$$mu$$mのLETで0に近づくけれども、OHラジカルの間接作用は高LET放射線による生物効果の相当な割合を占めることがわかった。生存率10%のRBEはLETとともに増加して200keV/$$mu$$mで最大値2.88に達し、それ以降は減少した。直接作用のRBEと間接作用のRBEを別個に評価するとき、両者のRBEはLETに依存し、200keV/$$mu$$mをピークとして同値になると考えられていた。しかし、本研究によりRBEのピーク値は間接作用よりも直接作用のほうが高いことがわかった。ゆえに、直接作用は間接作用に比べ、高LET放射線の高RBEに寄与している。

論文

The Yield, processing, and biological consequences of clustered DNA damage induced by ionizing radiation

鹿園 直哉; 野口 実穂; 藤井 健太郎; 漆原 あゆみ*; 横谷 明徳

Journal of Radiation Research, 50(1), p.27 - 36, 2009/01

 被引用回数:79 パーセンタイル:13.22(Biology)

クラスターDNA損傷は、電離放射線照射により電離や励起が空間的に不均一に生じることに由来して、ある確率で多数のDNA損傷が局所的に密集(クラスター化)したものであり、二本鎖切断型と非二本鎖切断型に大別される。電離放射線によって生じる二本鎖切断は、細胞死や染色体異常といった生物学的なendpointに深く関連し生物学的に重要な損傷と考えられてきた。そのため、二本鎖切断の生成効率,修復効率さらには修復過程やシグナル伝達に至るまで、これまでに膨大な研究の蓄積がある。一方、非二本鎖切断型クラスターDNA損傷も生物効果が高いと考えられていたにもかかわらず、その検出が難しいことから研究がなかなか進まなかった。しかしながら、検出法の進展に伴い、近年研究が活発に行われてきている。非二本鎖切断型のクラスターDNA損傷が、(1)放射線によってどのくらい生成され、(2)どのようにプロセシングされるのか、(3)生物効果に関連するのか、という点に焦点を当てて研究の現状をまとめた。

口頭

17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin enhances the cytotoxicity of tumor cells irradiated with carbon ions

野口 実穂; 平山 亮一*; 岡安 隆一*

no journal, , 

Hsp90阻害剤17-AAGは単独でも抗腫瘍効果を持ち、放射線や他の化学療法剤と組合せることでさらに高い抗腫瘍効果が報告されている薬剤である。われわれ17-AAGはHIMAC炭素イオン線の細胞殺傷効果に影響を与えるかどうかを検討した。細胞は前立腺癌DU145,ヒト胎児肺線維芽細胞HFLIIIを用いた。17-AAGは照射前に24時間、100nMを投与した。また炭素線は炭素線治療に用いられているLET70keV/umを用いて実験を行った。17-AAGはDU145細胞において10%生存率で2.13倍の増感効果を示した。しかし、正常細胞では17-AAGの増感は現れなかった。DU145細胞において17-AAGの炭素線増感に対するDNA二本鎖切断(DSB)修復への影響を定電圧電気泳動法にて調べた。炭素線はX線と異なり炭素線単独でも非常にDSB修復が悪く、17-AAGを投与しても全く影響は見られなかった。しかし、Rad51フォーカス形成は炭素線単独と17-AAGと炭素線を併用したときとでは大きな違いが見られた。しかし、この薬剤による相同組換え修復経路の阻害は炭素線増感に大きな可能性が示唆される。

口頭

Hsp90阻害剤による放射線増感; DNA二本鎖切断修復への影響

野口 実穂; Yu, D.*; 平山 亮一*; 窪田 宜夫*; 岡安 隆一*

no journal, , 

Hsp90阻害剤17-AAGは単独投与で抗腫瘍効果を持ち、放射線や他の化学療法剤と組合せると、これらの効果を増強し、より高い抗腫瘍効果を誘導することが報告されている薬剤である。17-AAGによる放射線増感のメカニズムとしては細胞増殖抑制やアポトーシスの誘導等が報告されている。しかし、X線との併用による放射線増感効果は非常に大きく、さらに別なメカニズムの存在が推測される。そこでわれわれは放射線による細胞死の主原因であるDNA二本鎖切断(DSB)の修復に焦点を当て、17-AAGがDSB修復過程に影響を与えるかどうかを検討した。今回の結果では17-AAGは癌細胞に特異的に放射線増感効果を示し、そのメカニズムにDSB修復の阻害が関与していることが示唆された。これは17-AAGによりBRCA2, Rad51発現量が減少したことに起因し、その結果、放射線照射後のRad51フォーカス形成が阻害されたと考えられる。したがって、17-AAGは特に相同組換え修復経路を阻害することが明らかとなった。

口頭

The Mutation frequency of 8-oxo-7,8-dihydroguanine when single strand break is closely present on the same or the opposite strand

野口 実穂; 漆原 あゆみ*; 横谷 明徳; 鹿園 直哉

no journal, , 

放射線の1トラックでDNAの1-2ヘリカルターン(10$$sim$$20bp)に2個以上の損傷を生じたものをクラスターDNA損傷と定義している。クラスター損傷の中でも非二本鎖切断型クラスター損傷は損傷の検出が難しく、研究がほとんど進んでいない。本研究ではさまざまな修復欠損を持つ大腸菌株を利用し、塩基損傷を伴う複雑な鎖切断を突然変異誘発という指標から検討した。本研究では人工的に合成したモデルクラスター損傷を用いて実験を行った。モデルクラスター損傷として8-oxoGと鎖切断を用い、制限酵素認識配列中に8-oxoGがあり、両者を同一鎖、及び相補鎖に配置したオリゴヌクレオチドを設計した。このオリゴヌクレオチドをpUC18プラスミドにligationさせた後、大腸菌野性株、及びグリコシラーゼ欠損株(fpg, mutY, fpg mutY)に形質転換した。その後プラスミドを大腸菌から回収し、損傷による突然変異を制限酵素により切断されない断片として検出し、突然変異の誘発率を求めた。8-oxoGと相補鎖の鎖切断とのクラスター損傷では8-oxoG単独の損傷よりも突然変異誘発率が上昇したが、8-oxoGと鎖切断とが同一鎖上にあるクラスター損傷では8-oxoG単独の損傷と同程度の突然変異誘発率を示した。以上から8-oxoGと鎖切断とのクラスター損傷では鎖切断が二本鎖のどちらに存在するかにより突然変異誘発率が大きく変化することが示唆された。

口頭

Mutagenic potential of non-DSB clustered damage containing 8-oxoG and single strand break

野口 実穂; 漆原 あゆみ*; 横谷 明徳; 鹿園 直哉

no journal, , 

クラスターDNA損傷は1$$sim$$2ヘリカルターン(10$$sim$$20bp)に2個以上の損傷を生じたものと定義される。電離放射線により生成されるクラスターDNA損傷の中で二本鎖切断は細胞死や染色体異常に直結する損傷と考えられており、その生成効率や修復効率,修復過程やシグナル伝達に至るまで研究が進んでいる。しかし、非二本鎖切断型クラスター損傷においては高い生物効果が予測されるが、損傷の検出が難しく、研究がほとんど進んでいない。本研究では塩基損傷に鎖切断を伴う複雑な損傷について、2種のDNAグリコシラーゼを欠損した大腸菌株を用いて突然変異誘発を検討した。8-oxoGと相補鎖の鎖切断とによるクラスター損傷の場合、8-oxoG単独の損傷よりも突然変異誘発率が上昇した。しかし、8-oxoGと鎖切断とが同一鎖上にあるクラスター損傷では8-oxoG単独の損傷に比べ突然変異誘発率の顕著な上昇は認められなかった。以上から(1)8-oxoGと相補鎖の鎖切断の場合、相補鎖の鎖切断が8-oxoGの修復を阻害する。(2)同一鎖の場合、8-oxoGは鎖切断の修復に伴い除去されている可能性があることが考えられ、8-oxoGと鎖切断とのクラスター損傷では鎖切断が二本鎖のどちらに存在するかにより突然変異誘発率が大きく変化することが示唆された。

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