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廣瀬 エリ; 横谷 明徳*; 野口 実穂*; Huart, L.*; 鈴木 啓司*
放射線生物研究, 59(2), p.134 - 156, 2024/06
細胞が放射線照射を受けた後、どのようなプロセスをたどって長期期間を経て現れる発がんなどの放射線影響につながるのか、放射線の長期影響をゲノムの構造・機能変化とエネルギー代謝の2つの視点から論じる。放射線によるゲノムへの長期影響の一つとして、ゲノム不安定性が子孫細胞に受け継がれることがわかってきた。X線照射によりX染色体上のHPRT1遺伝子座に欠失を有するヒト細胞のクローン株を樹立し、これらを用いて筆者らが子孫細胞に受け継がれた大規模なDNA欠失を調べたところ、欠失部位の両端にはっきりとした境目がなく、少なくともX染色体上の約130-137 Mbにわたって、DNA欠失部分と残存部分がパッチワーク状に混在していることが分かった。これはX線照射時における細胞核内でのDNAの収納のされ方に依存して、放射線エネルギー付与の空間密度を反映したDSBの分布を示していると考えられる。また、一般に考えられている1Gyあたり約40個/細胞に生じるDSBの頻度を考慮すると、非DSB型クラスターDNA損傷の塩基除去修復によって引き起こされる 二次的なDSBに起因する欠失も生じたと考えられる。さらに、複雑なDNA欠失パターンがゲノム全体の機能に及ぼす影響を、遺伝子発現を指標に調べたところ、遺伝子発現変動は大規模欠失領域の近傍だけでなくDNA欠失が位置するX染色体全域に及んでいた。これは、二次的なDSBに伴うCTCF結合サイトの欠失が要因であることを示唆している。他方、放射線照射後に細胞周期から離脱し細胞周期を不可逆的に停止した細胞(放射線誘発早期老化細胞)の場合、放射線の長期影響がエネルギー代謝に現れる。放射線誘発早期老化細胞は、細胞周期が回転しないため、DNA合成や細胞分裂に必要なエネルギーは不要で、このため、正常細胞と比較してエネルギー代謝活性は、一見、低いと予想されがちである。しかし、ミトコンドリアの膜電位差を通じて代謝活性を調べたところ、放射線誘発早期老化細胞では、代謝活性が上昇する様子が観察され、代謝活性化に伴うATP量の増加も合わせて報告された。ミトコンドリア活性の亢進に伴い生産された活性酸素種が近傍の細胞の損傷を誘発すると考えられることから、放射線誘発早期老化細胞は長期にわたって周囲の正常細胞にも影響を与えることが予想される。本稿ではこのような、長い時間が経っても残り続ける放射線の"爪痕"について論じる。
神長 輝一; 野口 実穂; 成田 あゆみ; 坂本 由佳; 嘉成 由紀子; 横谷 明徳
Radiation Protection Dosimetry, 166(1-4), p.91 - 94, 2015/09
被引用回数：7 パーセンタイル：49.28(Environmental Sciences)To explore radiation effects on the mammalian cell cycle, it would be essential to trace single cells as live cell images observed by a time-lapse imaging technique. HeLa-FUCCI cells are one of useful model cell lines to visualize cell cycle because their nucleus show different colors. We irradiated the cells with X-rays of 5 Gy. The cells were incubated for 48 hr in a small incubator set on a fluorescent microscope to track about 40 cells. Most of the irradiated cells underwent cell division at M phase, and then progressed into G1 phase. However, about a half of the cell population showed a significantly longer period toward cell division, indicating that G2 phase was prolonged (G2 arrest) by irradiation. The elongation of G2 phase was more prominent for irradiation to cells in S/G2 phase than those in G1 phase. The observed cell cycle modification suggests that G2/M checkpoint system control the cycle to ensure repairing DNA damage.
成田 あゆみ; 神長 輝一; 横谷 明徳; 野口 実穂; 小林 克己*; 宇佐美 徳子*; 藤井 健太郎
Radiation Protection Dosimetry, 166(1-4), p.192 - 196, 2015/09
被引用回数：3 パーセンタイル：24.66(Environmental Sciences)動物培養細胞の細胞周期に依存した放射線照射影響に関する知見は、そのほとんどが照射された細胞集団を統計学的手法により解析したものである。本研究は、照射された細胞一つを顕微鏡下で直接追跡することにより、刻々と変化する照射細胞の挙動をリアルタイムで観察する手法を確立することを目的とした。照射細胞には細胞周期が判別できるFUCCI(Fluorescent Ubiquitination-based Cell CycleIndicator)発現HeLa細胞(ヒトがん細胞)を用いた。また、照射には細胞一つ分まで大きさが調整できる放射光X線マイクロビームを利用した。さらに照射した細胞を長時間観察するために、細胞を培養しながら観察可能なタイムラプス顕微鏡を立ち上げ、照射した個々の細胞の分裂の様子を追跡した。その結果、G1期で照射した細胞では周期の遅延が認められなかった。それに対してS/G2期にある細胞に照射を行ったところ、明確な周期遅延が観察された。以上から、顕微鏡下での長時間観察によって、放射線照射された細胞への影響をリアルタイムで観察することができた。
野口 実穂; 嘉成 由紀子; 横谷 明徳; 成田 あゆみ; 藤井 健太郎
Radiation Protection Dosimetry, 166(1-4), p.101 - 103, 2015/09
被引用回数：1 パーセンタイル：9.26(Environmental Sciences)It is well known that radiosensitivity of cells is dependent on cell cycle phases. In general, cells are most radiosensitive in M phase and most resistant in late S phase. Cell cycle-dependent radiosensitivity seems to be involved in DSB repair ability which is varied in each cell cycle. Maeda et al. reported that radiation induced cell death depends on not only DSB induction and its repair in a cell nucleus but also damaging cytoplasm, suggesting that cytoplasm may play an important role in the radiobiological responses. Mitochondria, a kind of major organelles, are distributed throughout cytoplasm. They are continuously fusing or dividing. Mitochondrial morphology is also known to change dynamically depending on cell cycle. In this study, to investigate whether mitochondrial morphology relates to cell cycle-dependent radiosensitivity, we analyzed kinetics of mitochondrial morphology after irradiation of X-rays. Fragmented mitochondria were found to accumulate in proliferating cells irradiated with X-rays. Cell population with fragmented mitochondria increased with time after irradiation. When cells irradiated in M phase, cell population with fragmented mitochondria also increased with time after irradiation. These results suggest that the changes of mitochondrial morphology are not significantly related to the cell cycle phase at which the cells are irradiated, and might have little association with cell cycle-dependent radiosensitivity.
嘉成 由紀子; 野口 実穂; 神長 輝一; 坂本 由佳; 横谷 明徳
Journal of Radiation Research, 55(Suppl.1), p.i129 - i130, 2014/03
In this study, we report a new approach of tracing the mitochondrial morphological change of the cells exposed to high LET radiation using a live-cell imaging technique. We used the NMuMG (Normal murine mammary gland)-FUCCI2 cell line. Using the FUCCI2 expressing cells, we can observe red fluorescence in the nuclei of G1 phase cells and green fluorescence in the nuclei of S/G2/M phase cells. We labeled mitochondria by Mitotracker Red. Kinetics of mitochondrial morphology was analyzed by the live-cell imaging technique using a fluorescence microscope. Mitochondrial images were captured for 4 days after irradiation. In a preliminary study, we found that X-ray irradiation of cells caused mitochondrial fragmentation, and proportion of cell population with fragmented mitochondria increased with increasing dose and with time after irradiation. It is demonstrated that the method proposed in this study works successively to trace cytoplasmic effects by high LET irradiation.
神長 輝一; 坂本 由佳; 嘉成 由紀子; 野口 実穂; 横谷 明徳
Journal of Radiation Research, 55(Suppl.1), p.i127 - i128, 2014/03
Fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator (FUCCI) HeLa cells are one of useful model cell lines to visualize a cell-cycle because their nuclei show different colors; orange indicating G1; green indicating S/G2. In order to establish a novel assay system to study cell-cycle modification by high LET irradiation such as ion beams for cancer therapy we have observed time-lapse images of HeLa-FUCCI cells irradiated as a preliminary experiment using conventional X-rays instead of high LET ion beams. The cell-cycle was strongly arrested by irradiation at S/G2 and never progressed to G1. In contrast, cells irradiated at G1 progress to S/G2 with a similar time course as non-irradiated control cells. These results show that single FUCCI cell exposure and live cell imaging are a powerful method to trace the single cell effect of high LET irradiation on the cell-cycle in future.
坂本 由佳; 神長 輝一; 嘉成 由紀子; 野口 実穂; 横谷 明徳
Journal of Radiation Research, 55(Suppl.1), p.i120 - i121, 2014/03
In order to examine bystander effects in the 3D cell system, we have developed a FUCCI-HeLa spheroid system. FUCCI (Fluorescent Ubiquitination-based Cell Cycle Indicator) cells show specific colors of cell nuclei depending on a cell cycle. Thus we can easily trace cell cycle modifications by irradiation. We observed bystander cell-cycle delay as preliminary tests using monolayer culture of the HeLa-FUCCI cells. It will be very interesting to examine whether the cell-cycle effect also appears in the 3D cell system exposed to single high LET particles. We have determined suitable conditions for the spheroid culture, such as size of spheroids and methods of stable fixing a spheroid in a dish to perform the microbeam irradiation, and observation of the cell cycles of each cell in a spheroid after irradiation using a time-lapse micro-imaging technique.
processing of clustered DNA damage鹿園 直哉; 赤松 憲; 高橋 桃子*; 野口 実穂; 漆原 あゆみ; O'Neill, P.*; 横谷 明徳
Mutation Research; Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 749(1-2), p.9 - 15, 2013/09
被引用回数：14 パーセンタイル：40.37(Biotechnology & Applied Microbiology)クラスターDNA損傷は、電離放射線によってDNAへリックス二回転中に二つ以上の損傷が生じるものである。クラスターDNA損傷がどの程度、また、どのように生物影響を及ぼすのかに関しては不明な点が多い。本研究では、鎖切断と脱塩基部位や8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG)を含むクラスターDNA損傷を用い、大腸菌に形質転換し、形質転換効率及び突然変異頻度を調べた。鎖切断と脱塩基部位からなるクラスターDNA損傷の場合、鎖切断及び脱塩基部位がそれぞれ単独であった場合に対し、形質転換効率は大幅に低下することが明らかになった。損傷間の距離を離す(10-20bp)と、形質転換効率はDNA polymerase I(Pol I)の作用により回復した。一方、鎖切断と8-oxoGからなるクラスターDNA損傷の場合、クラスターDNA損傷による突然変異頻度はPol Iの働きによって低下することが明らかとなった。これらの結果は、クラスターDNA損傷による生物効果にPol Iが深く関与することを示している。
平山 亮一*; 鵜澤 玲子*; 高瀬 信宏*; 松本 孔貴*; 野口 実穂; 幸田 華奈*; 尾崎 匡邦*; 山下 慶*; Li, H.*; 加瀬 優紀*; et al.
Mutation Research; Genetic Toxicology And Environmental Mutagenesis, 756(1-2), p.146 - 151, 2013/08
被引用回数：26 パーセンタイル：61.17(Biotechnology & Applied Microbiology)The aim of this study was to measure the RBE (relative biological effectiveness) and OER (oxygen enhancement ratio) for survival of cells within implanted solid tumors following exposure to 290 MeV/nucleon carbon-ion beams or X-rays. Squamous cell carcinoma cells (SCCVII) were transplanted into the right hindlegs of syngeneic C3H male mice. Irradiation with either carbon-ion beams with a 6-cm spread-out Bragg peak (SOBP, at 46 and 80 keV/
m) or X-rays was delivered to 5-mm or less diameter tumors. We defined three different oxygen statuses of the irradiated cells. Hypoxic and normoxic conditions in tumors were produced by clamping or not clamping the leg to avoid blood flow. The RBE values increased with increasing LET in SOBP beams. The OER values of carbon-ion irradiated samples were small in comparison to those of X-ray irradiated samples. However, no significant changes of the OER at proximal and distal positions within the SOBP carbon-ion beams were observed. To conclude, we found that the RBE values for cell survival increased with increasing LET and that the OER values changed little with increasing LET within the SOBP carbon-ion beams.
野口 実穂; 漆原 あゆみ; 横谷 明徳; O'Neill, P.*; 鹿園 直哉
Mutation Research; Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 732(1-2), p.34 - 42, 2012/04
被引用回数：17 パーセンタイル：46.30(Biotechnology & Applied Microbiology)In vivoにおいて塩基損傷を伴った鎖切断の効果はいまだ多くが不明である。本研究においてわれわれは1ヌクレオチドgap(GAP)と8-oxoGから成るクラスターDNA損傷の突然変異誘発性について明らかにした。MutY欠損株において、GAPと8-oxoGの2つの損傷から成り、これらが相補鎖にまたがって存在するクラスター損傷の変異頻度は8-oxoGとAPサイトから成るクラスター損傷とほぼ同じ値を示したことから、クラスター損傷内において、GAPはAPサイトと同様に処理されることが示唆された。GAPと8-oxoGが同一鎖上に存在するクラスター損傷の変異頻度は8-oxoG単独損傷とほぼ等しい値であった。3つの損傷から成るクラスター損傷(GAPと8-oxoGが相補鎖、その同一鎖上にもう一つの8-oxoG)の変異頻度は8-oxoG単独損傷より高い値であったが、2つの8-oxoGが相補鎖にまたがって存在するクラスター損傷に比べて低い値であった。これらの結果から、クラスター損傷内にGAPが存在する場合、存在しない場合に比べて、8-oxoGの鋳型として向いに挿入されるヌクレオチドの変異誘発性が低くなることが示唆された。さらに、GAPの修復は相補鎖の8-oxoGにより阻害されるが、同一鎖の8-oxoGには阻害されないことが示唆され、GAPの修復が生物影響に大きく影響を与えることが示された。
He
ion irradiation横谷 明徳; 鹿園 直哉; 藤井 健太郎; 野口 実穂; 漆原 あゆみ
Radiation Protection Dosimetry, 143(2-4), p.219 - 225, 2011/02
被引用回数：3 パーセンタイル：25.34(Environmental Sciences)高LET放射線によりDNA上に多重1本鎖切断(m-SSBs)が生じることが予測されているが、これまでのプラスミドDNAをモデル分子として用いる手法ではその収率を過小評価してしまう可能性がある。なぜなら複数のSSBがDNAの同一鎖上あるいは2本鎖切断(DSB)にはならない程度離れた反対鎖上に生じた場合はこれを検出することができないためである。われわれはDNA変性を利用した新しいm-SSBsの検出法を開発してきた。この方法では、m-SSBsは1本鎖DNAの分子量変化として電気泳動法により定量される。今回X線及びHeイオンビームが照射された水和pUC18プラスミドDNA中に生じたm-SSBsを定量した。得られた結果は、実験の分解能の範囲内で(
140塩基)1本鎖DNAの半分は無傷で残っているというものであった。これは当初の予想に反し、高LET放射線照射であってもm-SSBs損傷は140塩基対を超えた領域には広がらないことを示唆している。
平山 亮一*; 鵜沢 玲子*; 松本 孔貴*; 野口 実穂; 加瀬 優紀*; 高瀬 信宏*; 伊藤 敦*; 小池 幸子*; 安藤 興一*; 岡安 隆一*; et al.
Radiation Protection Dosimetry, 143(2-4), p.508 - 512, 2011/02
被引用回数：14 パーセンタイル：70.87(Environmental Sciences)マウスの足に移植した腫瘍の上部をクランプした、又はクランプしない状態で80keV/mの炭素線、及びX線を照射したときのDSBの誘導、及び再結合について調べた。腫瘍のDSB生成量は定電圧電気泳動法により測定した。X線照射後のDSBのOERは1.68
0.31で、この値は照射1時間後での変化は見られなかった(1.400.26)。In situにおいて、酸素存在下でのこれらの損傷は1時間で60から70%が再結合した。炭素線とX線照射下において、DSBの誘発及び再結合の割合に違いは見られなかった。ゆえに、炭素線照射後のOER値及び再結合率はX線照射後と同じであり、炭素線のRBEは酸素存在下で1に近い値となった。In vivoにおけるDSBの収量は照射線量、酸素の状況、再結合時間に依存し、放射線の種類には依存しないと考えられる。
鹿園 直哉; 横谷 明徳; 漆原 あゆみ; 野口 実穂; 藤井 健太郎
Radiation Protection Dosimetry, 143(2-4), p.181 - 185, 2011/02
被引用回数：2 パーセンタイル：17.88(Environmental Sciences)Although it is widely accepted that the spatial distribution of strand breaks is highly relevant to the biological consequences of radiation, the extent to which strand breaks are clustered is not usually demonstrated directly from experimental data. To evaluate the spatial distribution of radiation-induced strand breaks, we have developed a model for the generation of strand breaks after irradiation. To find out whether the model is valid, we compared the calculated values to experimental data obtained by a plasmid DNA assay. Taking into account the inherent bias of the plasmid assay, the model described well the experimental results of hydrated plasmids exposed to radiation.
坂中 章悟*; 明本 光生*; 青戸 智浩*; 荒川 大*; 浅岡 聖二*; 榎本 収志*; 福田 茂樹*; 古川 和朗*; 古屋 貴章*; 芳賀 開一*; et al.
Proceedings of 1st International Particle Accelerator Conference (IPAC '10) (Internet), p.2338 - 2340, 2010/05
日本においてERL型放射光源を共同研究チームで提案している。電子銃,超伝導加速空洞などの要素技術開発を進めている。また、ERL技術の実証のためのコンパクトERLの建設も進めている。これら日本におけるERL技術開発の現状について報告する。
平山 亮一*; 松本 孔貴*; 加瀬 優紀*; 野口 実穂; 安藤 興一*; 伊藤 敦*; 岡安 隆一*; 古澤 佳也*
Radiation Physics and Chemistry, 78(12), p.1175 - 1178, 2009/12
被引用回数：13 パーセンタイル：64.07(Chemistry, Physical)低酸素下での粒子線照射によって生じるOHラジカルが介在する間接効果の寄与をラジカルスカベンジャーを用いて測定した。DMSO存在下、及び非存在下で、V79細胞に150MeV/nucleonのヘリウムイオンビームをLET2.2KeV/mmで照射し、コロニー形成法により生存率を決定した。低酸素下による細胞死への間接効果の寄与は約52%であった。われわれは低酸素下においてOHラジカルの介在する間接効果は全効果のおおよそ半分になると結論づけた。
野口 実穂; 平山 亮一*; Druzhinin, S.*; 岡安 隆一*
Radiation Physics and Chemistry, 78(12), p.1184 - 1187, 2009/12
被引用回数：4 パーセンタイル：29.90(Chemistry, Physical)ハービマイシンAはゲルダナマシンと同様Hsp90に結合し、Hsp90のシャペロン機能を阻害する薬剤である。Hsp90は自身のシャペロン活性により他のタンパク質の安定化を維持する働きをもち、癌細胞の成長や生存に重要な役割を果たしている。放射線照射に応答するタンパク質もHsp90により機能的に安定化されていることが知られている。そこで、本研究ではハービマイシンAが癌細胞の放射線感受性に影響を与えるかどうか、さらに放射線感受性の増強に関与する細胞内メカニズムを明らかにするため、実験を行った。特に放射線感受性のメカニズムとして、放射線誘発細胞死の主原因であるDNA二本鎖切断(DSB)とその修復について調べた。コロニー形成法により求めた生存率から、ハービマイシンAは癌細胞の放射線感受性を増強することが明らかになった。また、定電圧電気泳動法によりDSBの修復の経時的変化を調べたところ、ハービマイシンAを照射前に加えたほうが、DSBの修復効率が低下することが明らかになった。以上の結果から、ハービマイシンAは放射線誘発DSBの修復を阻害し、放射線感受性の増強を引き起こすことがわかった。ハービマイシンAと放射線併用は癌治療の新しい治療法として非常に有効であることが示された。
平山 亮一*; 伊藤 敦*; 冨田 雅典*; 塚田 照代*; 谷田貝 文夫*; 野口 実穂; 松本 孔貴*; 加瀬 優紀*; 安藤 興一*; 岡安 隆一*; et al.
Radiation Research, 171(2), p.212 - 218, 2009/02
被引用回数：125 パーセンタイル：95.74(Biology)放射線の生物効果はDNAの損傷を起源とする。X線と同様、重粒子線のDNA損傷も直接作用と間接作用のコンビネーションにより作られる。細胞死への間接作用の寄与はDMSOを用いた防護寄与率の最大値から算出することができる。対数増殖期のチャイニーズハムスターV79細胞に対し、DMSO存在下、及び非存在下で20から2106keV/mの高LET放射線を照射し、コロニー形成法により生存率を決定した。間接作用の寄与率は放射線のLETの増加に伴い減少した。しかし、寄与率は超高LET領域でも0にはならず、2106keV/mで32%と概算された。それゆえに、OHラジカルの放射線化学収量のG値は1000keV/mのLETで0に近づくけれども、OHラジカルの間接作用は高LET放射線による生物効果の相当な割合を占めることがわかった。生存率10%のRBEはLETとともに増加して200keV/mで最大値2.88に達し、それ以降は減少した。直接作用のRBEと間接作用のRBEを別個に評価するとき、両者のRBEはLETに依存し、200keV/mをピークとして同値になると考えられていた。しかし、本研究によりRBEのピーク値は間接作用よりも直接作用のほうが高いことがわかった。ゆえに、直接作用は間接作用に比べ、高LET放射線の高RBEに寄与している。
鹿園 直哉; 野口 実穂; 藤井 健太郎; 漆原 あゆみ*; 横谷 明徳
Journal of Radiation Research, 50(1), p.27 - 36, 2009/01
被引用回数：115 パーセンタイル：87.98(Biology)クラスターDNA損傷は、電離放射線照射により電離や励起が空間的に不均一に生じることに由来して、ある確率で多数のDNA損傷が局所的に密集(クラスター化)したものであり、二本鎖切断型と非二本鎖切断型に大別される。電離放射線によって生じる二本鎖切断は、細胞死や染色体異常といった生物学的なendpointに深く関連し生物学的に重要な損傷と考えられてきた。そのため、二本鎖切断の生成効率,修復効率さらには修復過程やシグナル伝達に至るまで、これまでに膨大な研究の蓄積がある。一方、非二本鎖切断型クラスターDNA損傷も生物効果が高いと考えられていたにもかかわらず、その検出が難しいことから研究がなかなか進まなかった。しかしながら、検出法の進展に伴い、近年研究が活発に行われてきている。非二本鎖切断型のクラスターDNA損傷が、(1)放射線によってどのくらい生成され、(2)どのようにプロセシングされるのか、(3)生物効果に関連するのか、という点に焦点を当てて研究の現状をまとめた。
坂中 章悟*; 吾郷 智紀*; 榎本 収志*; 福田 茂樹*; 古川 和朗*; 古屋 貴章*; 芳賀 開一*; 原田 健太郎*; 平松 成範*; 本田 融*; et al.
Proceedings of 11th European Particle Accelerator Conference (EPAC '08) (CD-ROM), p.205 - 207, 2008/06
コヒーレントX線,フェムト秒X線の発生が可能な次世代放射光源としてエネルギー回収型リニアック(ERL)が提案されており、その実現に向けた要素技術の研究開発が日本国内の複数研究機関の協力のもと進められている。本稿では、ERL放射光源の研究開発の現状を報告する。
鹿園 直哉; 野口 実穂; 漆原 あゆみ; O'Neill, P.*; 横谷 明徳
no journal, ,
本研究では、塩基損傷,脱塩基部位,鎖切断を両鎖に含むクラスターDNA損傷を用い、損傷を含むオリゴヌクレオチドをプラスミドに組み込んで大腸菌野生株に形質転換し、誘発される突然変異の特徴を塩基配列レベルで調べた。脱塩基部位からなるクラスター,鎖切断及び脱塩基部位からなるクラスターにおいては、形質転換効率は低いものの、脱塩基部位を鋳型にグアニンが挿入されるタイプの変化や脱塩基部位での1塩基対欠失が起こりやすいことが明らかになった。一方、8-oxoG及びDHTからなるクラスターやDHT及び鎖切断からなるクラスターにおいては、変異が生じる頻度は低いものの、損傷を配置した塩基対以外での塩基配列変化が観察された。これらの結果から、大腸菌野生株において、塩基損傷からなるクラスターDNA損傷の突然変異誘発過程では、(1)少なくとも一方の塩基損傷が残ること,(2)損傷部位の極近傍で変異を生成する場合があること、が示唆される。
