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鳴海 一成; 大庭 寛史*; Sghaier, H.*; Van Long, N.*; 佐藤 勝也*
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放射線抵抗性細菌由来のタンパク質PprAは、
で、DNA切断末端に結合し、エキソヌクレアーゼからDNA末端を保護すると同時に、ATP依存性並びにNAD依存性DNAリガーゼによるDNA末端結合反応を促進する活性を有しており、DNA修復促進タンパク質として、放射線抵抗性細菌に独特なDNA末端結合修復機構において重要な役割を担っていると考えられている。今回、PprAタンパク質のDNA結合活性に必要な領域を明らかにする目的で、変異型
遺伝子を発現している大腸菌BL21(DE3)株のコロニーの生育が、野生型遺伝子を発現している形質転換体よりも早いことを利用して、ランダム変異導入によるPprAタンパク質の機能欠損変異体の選抜を試みた。現在までに、Error-prone PCR法で9種類、ヒドロキシルアミン処理で2種類のアミノ酸置換変異体を選抜した。選抜した変異体のアミノ酸置換のほとんどは、133番目から210番目までのアミノ酸配列中に存在しており、この領域がPprAタンパク質のDNA結合能に重要な役割を果たしていると考えられた。
遺伝子の放射線応答プロモーターの解析大庭 寛史*; 佐藤 勝也*; 柳沢 忠*; 鳴海 一成
no journal, ,
放射線抵抗性細菌デイノコッカス・ラジオデュランスの優れたDNA二本鎖切断修復には、DNA損傷が生じた後に合成されるタンパク質が必要である。これまでに、デイノコッカス・ラジオデュランスの放射線抵抗性に中心的役割を担う新規放射線誘導性タンパク質PprAを同定した。しかしながら、放射線応答の分子機構を明らかにすることが重要であるにもかかわらず、放射線誘導性タンパク質の放射線応答プロモーターについてほとんど明らかにされていない。そこで本研究では、遺伝子プロモーターの放射線応答機構について解析を行った。放射線応答に関与するプロモーター領域を同定するため、ルシフェラーゼ遺伝子を用いたレポーターアッセイにより、放射線照射による遺伝子プロモーター活性変動を解析した。遠位のプロモーターは-208から-156領域に、近位のプロモーターは-57から-22領域に存在すること、そして、-57から-38領域が最小必要プロモーター領域であることを明らかにした。さらに、部位特異的変異導入法による解析から、-33位のチミンが放射線応答プロモーターの主要な塩基であることを明らかにした。また、
遺伝子産物は放射線応答において上位制御因子と考えられているが、遺伝子破壊株における遺伝子プロモーター活性を解析したところ、遺伝子発現は遺伝子産物によりプロモーターレベルで制御されていることが明らかになった。
Sghaier, H.*; 大庭 寛史*; 佐藤 勝也*; 鳴海 一成
no journal, ,
放射線抵抗性細菌デイノコッカス・ラジオデュランスの染色体と巨大プラスミドが、放射線などによって生じるDNA損傷に対する耐性を付与していることが示されている。しかしながら、微生物の環境耐性形質は、小型のプラスミドによっても規定される場合が多く、デイノコッカス属細菌が、染色体と巨大プラスミド以外に小型のプラスミドを細胞内に保有している理由に興味が持たれる。今回、デイノコッカス属細菌の小型プラスミド、デイノコッカス・グランディス由来pGRA1,デイノコッカス・ラジオプクナンス由来pUE30,デイノコッカス・ジオサーマリス由来pGEC1のDNA塩基配列を決定し、また、既にDNA塩基配列が決定されているデイノコッカス・ラジオデュランスBAA-816株由来のpCP1及びデイノコッカス・ラジオデュランスSark株由来のpUE10の塩基配列をも加えて、これらのプラスミドに存在する遺伝子群の機能を類推した。さらに、上記の解析をもとに、放射線抵抗性細菌の遺伝子操作を容易にするため、ベクター化に最適なプラスミドを提案する。
active site mutants in yeast坂本 綾子; Pavlov, Y. I.*; Kunkel, T. A.*
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DNAポリメラーゼ・ゼータ(ポル・ゼータ)は、ほとんどすべての真核生物に存在し、誤りがちな損傷乗り越え複製にかかわっていると考えられている。ポル・ゼータを欠失した酵母は、自然突然変異率及び紫外線誘発突然変異率がともに低下する。しかし、ポル・ゼータによる損傷バイバス機構や突然変異誘発機構については不明な点が多い。そこで、ポル・ゼータの突然変異誘発における機能を解明するために、今回われわれはポル・ゼータの活性中心部にアミノ酸置換の導入を試みた。DNAポリメラーゼ・アルファを用いた研究により、真核生物のB型ポリメラーゼのpalmサブドメインにあるロイシン残基が、ポリメラーゼの複製忠実度を維持するうえで非常に重要であることが報告されている。そこで、われわれは、ポル・ゼータの活性中心部で同じ位置に保存されているロイシンを他のアミノ酸残基に置き換え、突然変異率に及ぼす影響を酵母細胞を用いて調べた。作成したアミノ酸置換変異体のうち、rev3-L979M及び rev3-L979Fと名付けた2系統は、野生型系統と同程度の紫外線感受性を示したが、紫外線によって、より多くの突然変異を誘導することが明らかになった。このことから、ロイシンからメチオニン又はフェニルアラニンへの置換が、ポル・ゼータの酵素活性に影響を与えることなく、複製忠実度のみを特異的に低下させることが明らかになった。rev3-L979M及びrev3-L979F系統の高い変異誘発性は、真核生物のゲノム安定化機構におけるポル・ゼータの役割を解析するうえで、非常に有用なツールとなりうるだろう。