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The Mutation frequency of 8-oxo-7,8-dihydroguanine when single strand break is closely present on the same or the opposite strand

鎖切断と8-oxoGが相補鎖又は同一鎖にあるときの突然変異率

野口 実穂; 漆原 あゆみ*; 横谷 明徳; 鹿園 直哉

Noguchi, Miho; Urushibara, Ayumi*; Yokoya, Akinari; Shikazono, Naoya

放射線の1トラックでDNAの1-2ヘリカルターン(10$$sim$$20bp)に2個以上の損傷を生じたものをクラスターDNA損傷と定義している。クラスター損傷の中でも非二本鎖切断型クラスター損傷は損傷の検出が難しく、研究がほとんど進んでいない。本研究ではさまざまな修復欠損を持つ大腸菌株を利用し、塩基損傷を伴う複雑な鎖切断を突然変異誘発という指標から検討した。本研究では人工的に合成したモデルクラスター損傷を用いて実験を行った。モデルクラスター損傷として8-oxoGと鎖切断を用い、制限酵素認識配列中に8-oxoGがあり、両者を同一鎖、及び相補鎖に配置したオリゴヌクレオチドを設計した。このオリゴヌクレオチドをpUC18プラスミドにligationさせた後、大腸菌野性株、及びグリコシラーゼ欠損株(fpg, mutY, fpg mutY)に形質転換した。その後プラスミドを大腸菌から回収し、損傷による突然変異を制限酵素により切断されない断片として検出し、突然変異の誘発率を求めた。8-oxoGと相補鎖の鎖切断とのクラスター損傷では8-oxoG単独の損傷よりも突然変異誘発率が上昇したが、8-oxoGと鎖切断とが同一鎖上にあるクラスター損傷では8-oxoG単独の損傷と同程度の突然変異誘発率を示した。以上から8-oxoGと鎖切断とのクラスター損傷では鎖切断が二本鎖のどちらに存在するかにより突然変異誘発率が大きく変化することが示唆された。

Ionizing radiation induces clustered DNA damage which is defined as two or more lesions induced within 1-2 helical turns (10-20bp) of DNA by a single radiation track. Recent in vitro studies predict that the non-DSB clustered damage shows high biological effects. It is, however, technically difficult to directly detect non-DSB clustered damage site as well as its effect in living cells. In this study, we investigated the potential of single strand break (SSB) to influence the mutagenicity of base lesions in Escherichia coli. We used plasmid based assay to measure the mutation frequency induced by bistranded clustered damage. As models of clustered damage, we used synthesized oligonucleotides carrying a SSB and 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) at a restriction enzyme recognition site. Damaged DNA was transfected into wild-type or glycosylase-deficient strains (fpg, mutY, fpg mutY) of E coli and mutation frequency was assessed by the inability to cut by the restriction enzyme. Clustered damage containing 8-oxoG and SSB located on opposite strand raised mutation frequencies. However, clustered damage containing 8-oxoG and SSB positioned in tandem gave lower mutation frequency than single 8-oxoG lesion. We propose that the mutagenic potential of 8-oxoG depends on whether SSB is located on either strand, same or opposite, to 8-oxoG.

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