Chemical repair activity of free radical scavenger edaravone; Reduction reactions with dGMP hydroxyl radical adducts and suppression of base lesions and AP sites on irradiated plasmid DNA

端 邦樹; 漆原 あゆみ*; 山下 真一*; Lin, M.*; 室屋 裕佐*; 鹿園 直哉; 横谷 明徳; Fu, H.*; 勝村 庸介*

Journal of Radiation Research, 56(1), p.59 - 66, 2015/01

AA2014-0383.pdf:0.93MB

https://doi.org/10.1093/jrr/rru079

Reactions of edaravone (3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one) toward deoxyguanosine monophosphate (dGMP) hydroxyl radical adducts were investigated by pulse radiolysis technique. Edaravone was found to reduce the dGMP hydroxyl radical adducts through electron transfer reactions. The rate constants of the reactions were higher than 4 10 dm mol s and similar to those of the reactions of ascorbic acid, which is a representative antioxidant. Yields of single-strand breaks, base lesions, and abasic sites produced in pUC18 plasmid DNA by ray irradiation in the presence of low concentrations of edaravone were also quantified, and the chemical repair activity of edaravone was estimated by a method recently developed by the authors. By comparing suppression efficiencies to the induction of each DNA lesion, it was found that base lesions and abasic sites were suppressed by the chemical repair activity of edaravone, although the suppression of single-strand breaks was not very effective. This phenomenon is attributed to the chemical repair activity of edaravone toward base lesions and abasic sites. However, the chemical repair activity of edaravone for base lesions was lower than that of ascorbic acid.

Significance of DNA Polymerase I in processing of clustered DNA damage

鹿園 直哉; 赤松 憲; 高橋 桃子*; 野口 実穂; 漆原 あゆみ; O'Neill, P.*; 横谷 明徳

Mutation Research; Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 749(1-2), p.9 - 15, 2013/09

https://doi.org/10.1016/j.mrfmmm.2013.07.010

クラスターDNA損傷は、電離放射線によってDNAへリックス二回転中に二つ以上の損傷が生じるものである。クラスターDNA損傷がどの程度、また、どのように生物影響を及ぼすのかに関しては不明な点が多い。本研究では、鎖切断と脱塩基部位や8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG)を含むクラスターDNA損傷を用い、大腸菌に形質転換し、形質転換効率及び突然変異頻度を調べた。鎖切断と脱塩基部位からなるクラスターDNA損傷の場合、鎖切断及び脱塩基部位がそれぞれ単独であった場合に対し、形質転換効率は大幅に低下することが明らかになった。損傷間の距離を離す(10-20bp)と、形質転換効率はDNA polymerase I(Pol I)の作用により回復した。一方、鎖切断と8-oxoGからなるクラスターDNA損傷の場合、クラスターDNA損傷による突然変異頻度はPol Iの働きによって低下することが明らかとなった。これらの結果は、クラスターDNA損傷による生物効果にPol Iが深く関与することを示している。

The Mutagenic potential of 8-oxoG/single strand break-containing clusters depends on their relative positions

野口 実穂; 漆原 あゆみ; 横谷 明徳; O'Neill, P.*; 鹿園 直哉

Mutation Research; Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 732(1-2), p.34 - 42, 2012/04

https://doi.org/10.1016/j.mrfmmm.2011.12.009

In vivoにおいて塩基損傷を伴った鎖切断の効果はいまだ多くが不明である。本研究においてわれわれは1ヌクレオチドgap(GAP)と8-oxoGから成るクラスターDNA損傷の突然変異誘発性について明らかにした。MutY欠損株において、GAPと8-oxoGの2つの損傷から成り、これらが相補鎖にまたがって存在するクラスター損傷の変異頻度は8-oxoGとAPサイトから成るクラスター損傷とほぼ同じ値を示したことから、クラスター損傷内において、GAPはAPサイトと同様に処理されることが示唆された。GAPと8-oxoGが同一鎖上に存在するクラスター損傷の変異頻度は8-oxoG単独損傷とほぼ等しい値であった。3つの損傷から成るクラスター損傷(GAPと8-oxoGが相補鎖、その同一鎖上にもう一つの8-oxoG)の変異頻度は8-oxoG単独損傷より高い値であったが、2つの8-oxoGが相補鎖にまたがって存在するクラスター損傷に比べて低い値であった。これらの結果から、クラスター損傷内にGAPが存在する場合、存在しない場合に比べて、8-oxoGの鋳型として向いに挿入されるヌクレオチドの変異誘発性が低くなることが示唆された。さらに、GAPの修復は相補鎖の8-oxoGにより阻害されるが、同一鎖の8-oxoGには阻害されないことが示唆され、GAPの修復が生物影響に大きく影響を与えることが示された。

A Model for analysis of the yield and the level of clustering of radiation-induced DNA-strand breaks in hydrated plasmids

鹿園 直哉; 横谷 明徳; 漆原 あゆみ; 野口 実穂; 藤井 健太郎

Radiation Protection Dosimetry, 143(2-4), p.181 - 185, 2011/02

https://doi.org/10.1093/rpd/ncq528

Although it is widely accepted that the spatial distribution of strand breaks is highly relevant to the biological consequences of radiation, the extent to which strand breaks are clustered is not usually demonstrated directly from experimental data. To evaluate the spatial distribution of radiation-induced strand breaks, we have developed a model for the generation of strand breaks after irradiation. To find out whether the model is valid, we compared the calculated values to experimental data obtained by a plasmid DNA assay. Taking into account the inherent bias of the plasmid assay, the model described well the experimental results of hydrated plasmids exposed to radiation.

Studies of soft X-ray-induced Auger effect on the induction of DNA damage

横谷 明徳; 藤井 健太郎; 鹿園 直哉; 赤松 憲; 漆原 あゆみ; 渡辺 立子

International Journal of Radiation Biology, 84(12), p.1069 - 1081, 2008/12

https://doi.org/10.1080/09553000802534950

われわれはこれまで軟X線を生体試料に照射することで、DNA損傷過程におけるオージェ効果の寄与の程度を調べてきた。生体中で特定元素が内殻光吸収すると、オージェ効果が誘起され、光電子やオージェ電子が放出される。これらの低エネルギー電子は、分子内・外の他の官能基をさらにイオン化あるいは励起するため、数nm程度の領域に損傷が集中するいわゆる「クラスターDNA損傷」が生じやすいと予測される。これまでに、60keV付近の軟X線が-rayに比べ極めて高頻度の塩基除去修復酵素により認識・除去される塩基損傷を誘発すること、より低エネルギー(数keV以下)の軟X線ではこの頻度が低下することからクラスター損傷の生成が起こっていることなどが示唆された。さらに放射光軟X線ビームラインに設置したEPR装置を用いて、DNAの損傷の前駆体であるラジカル過程を調べた結果についても合せて報告する。

DNA damage induced by the direct effect of radiation

横谷 明徳; 鹿園 直哉; 藤井 健太郎; 漆原 あゆみ; 赤松 憲; 渡辺 立子

Radiation Physics and Chemistry, 77(10-12), p.1280 - 1285, 2008/10

https://doi.org/10.1016/j.radphyschem.2008.05.021

電離放射線の生体への照射により細胞内のDNAに、放射線のエネルギーの直接付与(直接過程)及び拡散性の水ラジカルとの反応(間接効果)を通じて化学的変化(損傷)が生じる。このような損傷は、突然変異などの放射線生物照射効果を誘発する主要な原因の一つとされている。われわれのグループでは、まだ不明な点が数多くある直接効果に着目し、モデルDNA分子として選んだプラスミドDNAに照射したときの1本鎖切断,2本鎖切断及び塩基損傷の収率の放射線の線質依存性を調べた。特に塩基損傷については、塩基除去修復酵素をプローブとして用いて定量した。さらに損傷生成の詳細を調べるため、放射光軟X線ビームラインに設置したEPR装置を用いて短寿命の塩基ラジカルを測定した。これらの実験データを過去に報告されているデータと比較し、直接効果によるDNA損傷の生成機構について議論する。

クラスターDNA損傷の生物効果

鹿園 直哉; 漆原 あゆみ; 藤井 健太郎; 横谷 明徳

放射線生物研究, 41(4), p.409 - 423, 2006/12

http://ci.nii.ac.jp/naid/40015265467

クラスターDNA損傷は、12ヘリカルターン(10-20bp)内に2個以上の損傷を生じたものとして定義され、二本鎖切断型と非二本鎖切断型に大別できる。電離放射線によって生じる二本鎖切断は、細胞死や染色体異常といった生物学的なendpointに深く関連し生物学的に重要な損傷と考えられてきた。そのため、二本鎖切断の生成効率,修復効率さらには修復過程やシグナル伝達に至るまで、これまでに膨大な研究の蓄積がある。一方、非二本鎖切断型クラスターDNA損傷も生物効果が高いと考えられていたにもかかわらず、その検出が難しいことから研究がなかなか進まなかった。しかしながら、検出法の進展に伴い、近年研究が活発に行われてきている。本稿では、非二本鎖切断型のクラスターDNA損傷が、(1)放射線によってどのくらい生成され、(2)どのようにプロセシングされるのか、(3)生物効果に関連するのか、という点に焦点を当てて研究の現状をまとめた。

DNA damage induced by the direct effect of He ion particles

漆原 あゆみ; 鹿園 直哉; 渡辺 立子; 藤井 健太郎; O'Neill, P.*; 横谷 明徳

Radiation Protection Dosimetry, 122(1-4), p.163 - 165, 2006/12

https://doi.org/10.1093/rpd/ncl425

近年、電離放射線の照射によって複数の損傷が近接したクラスターDNA損傷が生じ、これが放射線による致死や突然変異誘発等の原因であると予想されている。われわれはクラスター損傷の性質を解明するために、ヘリウムイオンビームのLETを変えて(19, 63及び95keV/m)、高水和状態に保ったpUC18プラスミドDNAに照射し、生じた鎖切断(ssb, dsb)生成頻度及び、照射後の修復酵素(Nth, Fpg)処理によって生じる鎖切断生成頻度の測定を行った。その結果、ssb生成量はほとんど変化しなかったが、dsb生成量はLETに依存して増加した。また、各修復酵素処理後の鎖切断の増加量を比較したところ、LETの増加に伴う酵素修復効率の低下が見られた。以上の結果は、単独で存在していた損傷がLETの増加に伴って徐々に密集し、クラスター化していくことを示唆するものである。また、酵素による修復効率のLET依存的な低下の理由として、クラスター化した損傷の修復の困難さと、密集した損傷であることによる検出限界の二つの可能性が考えられる。

放射線によりプラスミドDNAの両鎖に生じた非DSB性多重SSBのDNA変性を利用した新しい定量法

横谷 明徳; 漆原 あゆみ*; 藤井 健太郎; 鹿園 直哉

no journal, , 

われわれは、高密度電離放射線の照射により誘発される複雑なDNA損傷(クラスター損傷)の構造の解明を目指し、DNAの変性を利用する新しいアッセイ方法を開発した。照射したプラスミドDNAを、制限酵素(Hind III)で処理することで直鎖状にした後にホルムアミド(50% v/v)を加え、熱脆弱部位の切断が生じないよう37C, 5分間という穏やかな変性条件で処理することで1本鎖DNA(SS-DNA)にした。この後アガロース電気泳動法により放射線照射で切断されずに残存した無傷のSS-DNAの量を定量した。間接効果が支配的で1ヒット理論が十分適応できる希薄溶液試料に対してX線照射した場合には、予想通りDNAの方鎖だけが切断され相補鎖は無傷であることが、残存S S-DNAの線量効果曲線から結論された。講演では、本手法によるクラスターDNA損傷の直接観察への有効性を紹介する。

Mutagenic potential of non-DSB clustered damage containing 8-oxoG and single strand break

野口 実穂; 漆原 あゆみ*; 横谷 明徳; 鹿園 直哉

no journal, , 

クラスターDNA損傷は12ヘリカルターン(1020bp)に2個以上の損傷を生じたものと定義される。電離放射線により生成されるクラスターDNA損傷の中で二本鎖切断は細胞死や染色体異常に直結する損傷と考えられており、その生成効率や修復効率,修復過程やシグナル伝達に至るまで研究が進んでいる。しかし、非二本鎖切断型クラスター損傷においては高い生物効果が予測されるが、損傷の検出が難しく、研究がほとんど進んでいない。本研究では塩基損傷に鎖切断を伴う複雑な損傷について、2種のDNAグリコシラーゼを欠損した大腸菌株を用いて突然変異誘発を検討した。8-oxoGと相補鎖の鎖切断とによるクラスター損傷の場合、8-oxoG単独の損傷よりも突然変異誘発率が上昇した。しかし、8-oxoGと鎖切断とが同一鎖上にあるクラスター損傷では8-oxoG単独の損傷に比べ突然変異誘発率の顕著な上昇は認められなかった。以上から(1)8-oxoGと相補鎖の鎖切断の場合、相補鎖の鎖切断が8-oxoGの修復を阻害する。(2)同一鎖の場合、8-oxoGは鎖切断の修復に伴い除去されている可能性があることが考えられ、8-oxoGと鎖切断とのクラスター損傷では鎖切断が二本鎖のどちらに存在するかにより突然変異誘発率が大きく変化することが示唆された。