A Novel technique using DNA denaturation to detect prompt and enzymatically induced single strand breaks produced in a clustered damage site

DNA変性を利用した放射線誘発クラスターDNA損傷内の多重1本鎖切断の新しい定量法

横谷 明徳; 鹿園 直哉; 漆原 あゆみ*; 藤井 健太郎

Yokoya, Akinari; Shikazono, Naoya; Urushibara, Ayumi*; Fujii, Kentaro

放射線により誘発されるクラスターDNA損傷内の多重1本鎖切断を観測するため、DNA変性を利用した新しい定量法を開発した。本方法では、放射線照射されたDNAは1本鎖DNAに変性処理した後に分析される。多重1本鎖切断がDNA2重鎖の両鎖に分布し、かつ2本鎖切断に至らない場合には、アガロースゲル上の正常1本鎖DNAのバンド強度の、線量に依存した減少量を観測することで切断頻度が得られる。熱的処理による付加的なheat labile損傷を避けるため、変性処理は50%のフォルムアミドを加え37Cで行った。DNAの希薄溶液にX線を照射し1本鎖切断のほとんどがOHラジカルで生じる条件下で本実験系をテストしたところ、理論的に予測されるように閉環構造の線量効果曲線を利用するこれまでの手法で得られた線量効果曲線のちょうど1/2の傾きの1本鎖DNAの線量効果曲線が得られた。これにより、本方法の変性処理に起因するartifactによるDNA損傷は生じていないことが確認できたため、他の高LET放射線にもこの手法が適用できる見通しを得た。

In order to observe multiply single strand breaks induced by radiation in a clustered DNA damage site, we have developed a novel technique using DNA denaturation. The multiple SSBs which arise in both strands of plasmid DNA, but do not induce a DSB, are measured as decrease of the intact single strand DNA (SS-DNA) using agarose gel electrophoresis. To avoid induction of heat labile damage, we have determined lower denaturation temperature (37 C) using formamide (50% v/v). We have tested the validity of the new assay method by applying to the X-irradiated diluted DNA solution in which SSBs are mainly induced by OH radicals. The dose-response curve of the remaining SS-DNA fraction shows precisely a half slope of that for the closed-circular DNA as theoretically expected. This result indicates that the assay properly works without any artificial damages by the denaturation treatment. The obtained data for several radiations and experimental conditions will be presented.