中性子構造解析を目的としたNADH-チトクロームb5Rの結晶化

Crystallization of cytochrome b5 reductase aimed to neutron crystallography

正山 祥生; 玉田 太郎; 黒木 良太; 木村 成伸*; 竹田 一旗*; 林 拓郎*; 三木 邦夫*

Shoyama, Yoshinari; Tamada, Taro; Kuroki, Ryota; Kimura, Shigenobu*; Takeda, Kazuki*; Hayashi, Takuro*; Miki, Kunio*

NADH-チトクロームb5還元酵素(b5R)は、FADを持つピリジンヌクレオチド酵素でNADHからcytochrome b5への電子伝達を触媒する酵素である。b5Rは、脂肪酸代謝や、薬物代謝酵素であるチトクロームP450(CYP)の還元に関与している。われわれは、b5Rの構造活性相関を解明するとともに、薬物相互作用にかかわるCYPのb5Rによる還元機構を解明するため、その詳細な立体構造を解析することを目標としている。そのためにまず既報告の手法でブタ肝臓由来のb5Rの膜外領域に存在する触媒ドメインの大腸菌による大量調製を行った。その結果、大腸菌培養液1Lあたり15mgのb5Rを取得した。この試料を用いて既に報告されている結晶化条件[14% PEG4000を含む0.1Mリン酸緩衝液(pH7.7)]で結晶化を行った。結晶を中性子構造解析に用いるためには、大型の結晶を作製する必要がある。そこでマクロシーディング法と蛋白質試料を逐次添加することによって、結晶の大型化に取り組み、これまでに最大長辺が約1mmの大型結晶の調製に成功した。この結晶を用いて現在予備的中性子回折実験を実施中である。

NADH-cytochrome b5 reductase (b5R) is a pyridine nucleotide-dependent flavin reductase which contains a FAD in a molecule. The b5R catalyzes the electron transfer from NADH to cytochrome b5. The b5R is related to fatty acid metabolism and reduction of cytochrome P450. In order to clarify detailed structure of b5R, we carried out purification of b5R from E coli cell according to the method previously reported. Since a large-size crystal is necessary for the neutron structure analysis, we addressed enlargement of crystal by macroseeding method and periodical addition of protein sample to the crystallization solution. We succeeded in a preparation of large-scale crystal with a size of 1.00.50.3 mm, which is suitable for preliminary neutron diffraction study.