中性子構造解析を目的としたNADH-シトクロムRの結晶化

Crystallization of NADH-cytochrome reductase aimed to neutron crystallography

正山 祥生; 玉田 太郎; 黒木 良太; 木村 成伸*; 竹田 一旗*; 林 拓郎*; 三木 邦夫*

Shoyama, Yoshinari; Tamada, Taro; Kuroki, Ryota; Kimura, Shigenobu*; Takeda, Kazuki*; Hayashi, Takuro*; Miki, Kunio*

NADH-シトクロム 還元酵素(b5R)は、FADを持つピリジンヌクレオチド酵素でNADHからcytochrome への電子伝達を触媒する酵素である。このb5Rは脂肪酸代謝や薬物代謝酵素であるシトクロムの還元に関与することが明らかにされている。そこでわれわれはb5Rの構造活性相関を解明するとともに、薬物相互作用にかかわるCYPのb5Rによる還元機構を解明するため、中性子構造解析によって詳細な立体構造の解析を行うことを目標としている。そのためにまず既報告の手法でブタ肝臓由来のb5Rの膜外領域に存在する触媒ドメインの大腸菌による大量調製を行い、発現したb5Rを各種クロマトグラフィーによって高純度に単離精製した。その結果、大腸菌培養液1Lあたり15mgのb5Rを取得した。この試料を用いてb5Rの大型結晶作成に取り組み、マクロシーディングを行った結晶化溶液にタンパク質試料を逐次添加することで体積が約4mmの大型結晶の調製に成功した。また、この結晶を重水溶液に浸漬し予備的中性子回折実験を行ったところ、最大分解能が2程度の回折点を得ることに成功した。

NADH-cytochrome reductase (b5R) is a pyridine nucleotide-dependent flavin reductase which contains a FAD in a molecule. The b5R catalyzes the electron transfer from NADH to cytochrome b5. The b5R is related to fatty acid metabolism and reduction of cytochrome P450. In order to clarify detailed structure of b5R, we carried out purification of b5R from E coli cell according to the method previously reported. Since a large-size crystal is necessary for the neutron structure analysis. We addressed enlargement of crystal by macroseeding method and periodical addition of protein sample to the crystallization solution. We succeeded in a preparation of large-scale crystal with volume of 4 mm, and we did preliminary neutron diffraction study using this crystal. Then we got 2 resolution neutron diffraction data at BIX4.