Mutagenic potential of clustered DNA damage containing single strand break and 8-oxoGs

一本鎖切断と8-oxoGを含むクラスターDNA損傷の突然変異誘発性

野口 実穂; 漆原 あゆみ; 横谷 明徳; O'Neill, P.*; 鹿園 直哉

Noguchi, Miho; Urushibara, Ayumi; Yokoya, Akinari; O'Neill, P.*; Shikazono, Naoya

放射線は飛跡に沿ってDNA上にクラスターDNA損傷を生じ、その複雑性はLETの増加に伴い増す。非二本鎖切断(DSB)型クラスター損傷はDSB型損傷に比べて、生物効果が少ないといわれてきたが、近年のさまざまな研究によって、放射線誘発突然変異などの生物効果に寄与する可能性が示唆されている。そこで、本研究ではクラスター損傷の中でも比較的多く生じやすいとされている一本鎖切断(SSB)と塩基損傷からなるクラスター損傷の突然変異誘発性について調べた。損傷の突然変異頻度の測定には大腸菌によるPlasmid based assayを用いた。クラスター損傷はSSBと複数の8-oxoGを持つ損傷をモデル損傷として人工的に合成した。このとき、合成クラスター損傷は制限酵素認識配列を上に配置した。損傷を含むオリゴヌクレオチドをプラスミドDNAにつなぎ、野生株やDNAグリコシラーゼ欠損株などの複数の大腸菌に形質転換した。その後、大腸菌からプラスミドDNAを再び取り出し、制限酵素で処理し、突然変異誘発頻度を検出した。突然変異誘発頻度は8-oxoGの相補鎖2bp離れた位置に8-oxoGがある構造のクラスター損傷で最も高い変異頻度を示した。このような二つの8-oxoGからなるクラスター損傷の近傍に一つのSSBを配置すると、変異頻度は減少を示した。これはSSBと同一鎖にある8-oxoGの変異頻度がSSBの働きにより減少したためと考えられる。これらの結果から8-oxoGを含むクラスター損傷の変異頻度はクラスター損傷内にSSBがあるかどうかにより大きく影響を受けることが明らかになった。

It is proposed that a single track of ionizing radiation induces clustered DNA damage sites and that their complexity increases with increasing LET. Non-DSB clustered damage is thought to contribute to the biological effects of radiation such as mutation. In this study, we have investigated the mutagenicity of clustered DNA damage containing SSB and base damage. We have used a plasmid based assay with Escherichia coli to measure the mutation frequency induced by bistranded clustered damage. As a model of clustered damage, we have synthesized oligonucleotides containing a SSB and/or 8-oxo-7,8-dihydroguanines (8-oxoGs) within the recognition site of the restriction enzyme (Alw26I). Plasmid constructs containing damaged DNA was transfected into wild-type or glycosylase-deficient strains and propagated in cells. The mutation frequency was assessed by the inability of Alw26I to cut the oligonucleotide sequence. The mutation frequency of bistranded clusters containing an 8-oxoG opposite to a second 8-oxoG 2bp apart was the highest of all the types of clusters tested in the present study. When a SSB was included in clusters containing bistranded 8-oxoGs, the mutation frequency is lower in all E. coli strains tested. These results suggest that a SSB located on the same strand to one of the 8-oxoG reduces the mutagenic potential of 8-oxoG. Our studies demonstrate that the mutagenic potential of clusters containing 8-oxoG is modified if a SSB is present within the cluster.