重粒子線誘発DNA2本鎖切断定量のための研究開発; パルスフィールドゲル電気泳動を用いた従来の定量法の問題点

A Study on quantitative analysis of heavy-ion-induced DNA double-strand breaks; A Problem of conventional protocol using pulsed-field gel electrophoresis

横田 裕一郎; 舟山 知夫; 武藤 泰子; 坂下 哲哉; 菊地 正博; 小林 泰彦

Yokota, Yuichiro; Funayama, Tomoo; Muto, Yasuko; Sakashita, Tetsuya; Kikuchi, Masahiro; Kobayashi, Yasuhiko

高LETの重粒子線は物質内を通過する際、イオン飛跡の近傍にエネルギーを集中して付与する。このため、重粒子線が生体に照射されると、細胞内のゲノムDNA上に2本鎖切断(DSB)をはじめとするさまざまな損傷が局所的に誘発され、正確な修復が困難になると考えられている。定量性など多くの点で優れているパルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)法によるDSB定量解析実験で、重粒子線は低LET放射線と比べ、ゲノム上の近接した位置にDSBを誘発することが示されてきた。しかし、PFGE法をもってしても、10kbp以内に隣接して誘発されるようなDSBの定量は困難であった。本研究では、局所的に生じるDSBの定量が困難な理由を探った。従来のPFGE法では、実験操作による余計なDNA鎖切断を防ぐため、照射細胞をアガロース片に包埋した状態で細胞溶解とDNA精製が行われた。われわれは、この方法ではアガロース片から一部のDNAが流失してしまうことを見いだした。これは、10kbpより短い間隔で生じるDSBの定量が困難であったことを裏付けるものである。

Heavy-ion-induced DNA double-strand breaks (DSBs) have been focused to reveal the underlying mechanism of the well-known findings that relative biological effectiveness is greater in high-LET heavy ions than in low-LET radiation. Since 1990s, DSBs have been quantified with pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) technology. In conventional studies, DNA preparation from irradiated cells was performed in agarose plugs for avoiding excess DNA fragmentation during experimental procedures. However, we have found here that DNA fragments are partly lost from the agarose plug during DNA preparation. This makes difficult to reveal the total DSB yield in irradiated cells.