Creation and structure determination of an artificial protein with three complete sequence repeats

三回繰返し配列を有する人工タンパク質の創製とその結晶構造解析

安達 基泰; 清水 瑠美; 黒木 良太; Blaber, M.

Adachi, Motoyasu; Shimizu, Rumi; Kuroki, Ryota; Blaber, M.

ヒト線維芽細胞増殖因子(hFGF)の立体構造情報をもとにして創製した、三回繰り返し配列を有する人工タンパク質(Symfoil)に関して、さらに高い分解能による立体構造情報の取得を目指している。今回、Symfoilの化学的に不安定な配列の除去と繰り返し配列の完全性の向上したSymfoil改変体(Symfoil-II)を設計した。Symfoil-IIは、大腸菌を用いて可溶性分画に発現させた後、Niキレートカラムにより精製し、さらにプロテアーゼ消化によってHisTagを除去したものを陰イオン交換HPLCにより精製した。その後Symfoilの二次構造形成を円偏光二色性スペクトルで確認した。精製試料の収量は、培地1Lあたり約15mgであった。精製したSymfoil-IIは、Symfoilと同様の結晶化条件(1.8M(NH)SO, 0.1M TrisHCl pH7.0)で結晶化した。実験室系のX線回折計による予備実験によって1.9分解能の回折データを取得し、分子置換法で位相を決定した結果、Symfoilとは異なる結晶内分子パッキングを持つが、同様の高い対称性立体構造を有することがわかった。

We have already succeeded in creation of the de novo designed protein (Symfoil) exhibiting the threefold symmetrical -trefoil fold based on the human acidic fibroblast growth factor. Based on the Symfoil protein, we created Symfoil-II having the three repeats. The Symfoil-II protein was expressed in Eschericha coli as soluble protein, and purified by metal affinity chromatography using nickel-chelated agarose. The Symfoil-II was further purified by anion-exchange column chromatography after removing the HisTag by proteolysis. Symfoil-II was crystallized in 0.1 M Tris-HCl buffer (pH7.0) containing 1.8 M ammonium sulfate as precipitant at 20C. The X-ray diffraction data was collected to 1.9 resolution using a Rigaku R-AXIS VII diffractometer. The crystal belongs to a monoclinic space group C2. The refined crystal structure of Symfoil-II showed three fold symmetry as is observed in other Symfoils.