Initialising ...
Initialising ...
Initialising ...
Initialising ...
Initialising ...
Initialising ...
Initialising ...
-lactamaseのCs
選択性結合部位の発見新井 栄揮; 柴崎 千枝; 清水 瑠美; 安達 基泰; 玉田 太郎; 徳永 廣子*; 石橋 松二郎*; 徳永 正雄*; 黒木 良太
九州シンクロトロン光研究センター年報,2014, p.17 - 19, 2016/03
タンパク質は生物の生命活動のために、金属イオンの電荷数の違いやイオン半径のわずかな違いを識別して結合するなど、緻密な原子・分子認識機構を有する。多くのタンパク質が必須元素の金属を結合することは広く知られている。しかし、タンパク質が必須元素ではないセシウム(Cs)を選択して結合しうるのか、また、その結合部位はどのような構造をしているのか等は明らかにされていなかった。特に、東京電力福島第一原子力発電所事故によって放出された放射性Csの生物への影響を知るためや、タンパク質を利用したCs吸着剤を開発するためには、タンパク質におけるCsの結合のしやすさや結合部位の構造を解明することが重要と考えられた。そこで我々は、好塩性タンパク質とCsの相互作用の研究に着手した。好塩性タンパク質は、塩湖・岩塩・塩蔵食品・発酵食品などの高塩濃度環境に生息する好塩性細菌が作るタンパク質である。好塩性タンパク質は、高塩濃度環境に適応するために多く酸性アミノ酸を含有し、多くの負電荷を有することから、Csを含む様々な金属イオンを結合する可能性があると我々は考えた。本研究では、好塩性タンパク質の中でも比較的高い酸性アミノ酸含量を有し[(Asp + Glu) / (Arg + Lys) = 2.11]、かつ、大腸菌への遺伝子組換えによって大量調製が可能な好塩菌
sp. 560由来-lactamase (以下、HaBLA)について、立体構造の解明とCs結合部位の検出を試みた。
sp. ME121, isolated from soil as a mixed single colony with 
sp. 32K藤浪 俊*; 武田 喜代子*; 小野寺 威文*; 佐藤 勝也; 清水 哲*; 若林 佑*; 鳴海 一成*; 中村 顕*; 伊藤 政博*
Genome Announcements (Internet), 3(5), p.e01005-15_1 - e01005-15_2, 2015/09
sp. ME121 was isolated from soil as a mixed single colony with sp. 32K during our screening of L-glucose-utilizing microorganisms, and its growth was enhanced by coculture. It was expected that genomic analysis of this bacterium would provide novel information on coculture-dependent growth enhancement. The genomic information of symbiotic bacteria could be of use for studying the molecular mechanisms underlying microbial symbiosis. The draft genome sequence of sp. ME121 is 7,096,979 bp in total length and comprises 197 large contigs (
500 bp) that was deposited at DDBJ/EMBL/GenBank under the accession number BBUX00000000. The draft genome sequence shows that sp. ME121 has some genes that encode putative methanol/ethanol family PQQ-dependent dehydrogenases involved in methylotrophy. Some unknown factor provided by the coculture may contribute to increase the growth of sp. ME121.
-lactamase from the moderate halophile sp.560 and the discovery of a Cs-selective binding site新井 栄揮; 米澤 悌*; 岡崎 伸生*; 松本 富美子*; 柴崎 千枝; 清水 瑠美; 山田 貢*; 安達 基泰; 玉田 太郎; 河本 正秀*; et al.
Acta Crystallographica Section D, 71(3), p.541 - 554, 2015/03
被引用回数：7 パーセンタイル：50.54(Biochemical Research Methods)蛋白質を利用した希少・有害金属捕集材料の研究開発の一環として、中度好塩菌Chromohalobacter sp.560由来・高酸性-Lactamase(HaBLA)のX線結晶構造を解明するとともに、X線異常分散測定により、HaBLA分子上のCs, Sr
結合部位の抽出を試みた。PFのNW3AにてHaBLAのX線結晶構造を解明した後、Cs吸収端(
=2.175
)近傍のX線を利用できるSAGA-LSのBL7やPFのBL17A、及び、Sr吸収端(=0.770)近傍のX線を利用できるSPring-8のBL38B1やPFのBL5Aなどを使用して、HaBLA分子に結合したCs及びSrを同定した。その結果、HaBLA分子上に少なくとも1ヶ所のCs結合部位、3ヶ所のSr結合部位を発見した。特に、今回発見したCs結合部位は、NaがCsの9倍量存在する条件下(Na/Cs = 90mM/10mM)でもCsを選択的に結合できることが明らかになった。このCs選択的結合部位は、Trp側鎖のベンゼン環によるカチオン-
相互作用、および、主鎖の2つの酸素原子によってCsを結合していた。本研究で得たCs結合部位の立体構造情報は、原発事故によって放出された放射性Csを捕集する蛋白質材料の設計(人工的Cs結合部位の設計)の土台として利用できる。
安達 基泰; 平山 裕士; 清水 瑠美; 佐藤 勝也; 鳴海 一成*; 黒木 良太
Protein Science, 23(10), p.1349 - 1358, 2014/10
被引用回数：9 パーセンタイル：25.32(Biochemistry & Molecular Biology)DNAの修復に関与する多機能なPprAは、デイノコッカスラジオデュランスの高度な放射線耐性を促進する重要なタンパク質である。PprAによる放射線耐性機構を解明するために、大腸菌で発現した組換え型PprAと2本鎖DNAとの相互作用解析を実施した。ゲルシフトアッセイにより、PprAとスーパーコイル型のpUC19 DNAとの複合体のゲルシフトが2極性であり、それが1mMのMg, Ca, Srイオンで促進されることが示された。シフトしたバンドの相対的な割合からPprAとスーパーコイル型のpUC19 DNAとの複合体形成のヒル係数および解離定数を計算したところ、1mM Mgイオンの存在下で、それぞれ3.3と0.6
Mであった。このことは、PprAがスーパーコイル型のpUC19 DNAに少なくとも281分子結合していることを示しており、ゲル濾過での分離後にUV吸収で見積もられた値と一致した。この結果は、PprAが2本鎖DNAに沿って、直鎖状に重合して結合していることを示唆している。一方で、直鎖状の2本鎖DNAとニックがある環状DNAのバンドシフトに関しては、飽和が見られず、1.3M以上のPprA濃度の時、さらに大きな複合体の形成が確認された。この結果は、DNAに結合したPprAが、ダメージを受けたDNAの末端の会合を濃度依存的に促進していることを示している。
松尾 陽一郎*; 泉 佳伸*; 長谷 純宏; 坂本 綾子; 野澤 樹; 鳴海 一成*; 清水 喜久雄*
JAEA-Review 2013-059, JAEA Takasaki Annual Report 2012, P. 112, 2014/03
To investigate the nature of mutations induced by accelerated ions in eukaryotic cells, the effects of carbon-ion irradiation were compared with those of 
-ray irradiation in the budding yeast 
. Previous studies suggested that the mutation sites induced by carbon ions were localized near the linker regions of nucleosomes, whereas mutations induced by rays were located uniformly throughout the gene. We hypothesized that the locus of mutations might be related to the nucleosome structure. To confirm this hypothesis, we examined the mutation spectrum in the 
gene with the altered nucleosome structure. It is likely that sites of mutations occurred in the with altered nucleosome structure is inconsistent with those in the wild type. We will further accumulate the data to examine the above hypothesis.
仁宮 一章*; 表 小百合*; 佐藤 勝也; 鳴海 一成*; 清水 宣明*
JAEA-Review 2013-059, JAEA Takasaki Annual Report 2012, P. 115, 2014/03
In simultaneous saccharification and fermentation of biomass, pretreatment using ionic liquid has received a lot of attention in recent years. A enormous quantities of wastewater become a problem in washing from ionic liquid-pretreated biomass because ionic liquid is highly poisonous. In this study, simultaneous saccharification and fermentation from ionic liquid-pretreated biomass was carried out using ionic liquid-tolerant yeast that was obtained from the mutant population prepared by irradiation with carbon ion beams (220 MeV 
C
, 100 Gy). By using the ionic liquid-tolerant yeast strain, we could simplify the washing procedure of ionic liquid-pretreated biomass prior to the simultaneous saccharification and fermentation.
安達 基泰; 清水 瑠美; 黒木 良太; Blaber, M.
Journal of Synchrotron Radiation, 20(6), p.953 - 957, 2013/11
被引用回数：2 パーセンタイル：13.13(Instruments & Instrumentation)Symfoil-4Pは、ヒト酸性繊維芽細胞増殖因子を基に設計した3回対称なベータトレフォイル構造をもつ人工タンパク質である。脱アミド反応を防ぐためにアスパラギン-グリシン配列を除去した変異体Symfoil-QGおよびSymfoil-SGを作製し、さらにSymfoil-QGにHisTagを付加したものをHis-Symfoil-IIとした。His-Symfoil-IIは、プロテアーゼ処理によりHisTagを除去することで、完全な3回繰り返し配列をもつことになる。各タンパク質は、大腸菌内で可溶性タンパク質として発現し、Niカラムにより精製した。Symfoil-IIについては、HisTagをプロテアーゼ処理により除去した後に陰イオン交換カラムを用いて精製した。Symfoil-QGとSymfoil-IIをそれぞれ、1.5および1.1分解能で結晶構造解析した。精密化したSymfoil-IIは、他のSymfoilと同等に疑似3回軸を持っていることが示された。
spp. under the ISS environmental conditions for performing exposure experiments of microbes in the Tanpopo mission河口 優子*; Yang, Y.*; 川尻 成俊*; 白石 啓祐*; 高須 昌子*; 鳴海 一成*; 佐藤 勝也; 橋本 博文*; 中川 和道*; 谷川 能章*; et al.
Origins of Life and Evolution of Biospheres, 43(4-5), p.411 - 428, 2013/10
被引用回数：41 パーセンタイル：80.71(Biology)In the Tanpopo mission, we have proposed to carry out experiments on capture and space exposure of microbes at the Exposure Facility of the Japanese Experimental Module of the International Space Station (ISS). Microbial candidates for the exposure experiments in space include spp. We have examined the survivability of spp. under the environmental conditions in ISS in orbit. A One-year dose of heavy-ion beam irradiation did not affect the viability of spp. within the detection limit. Exposure of various thicknesses of deinococcal cell aggregates to UV radiation revealed that a few hundred micrometer thick aggregate of deinococcal cells would be able to withstand the solar UV radiation on ISS for 1 year. We concluded that aggregated deinococcal cells will survive the yearlong exposure experiments. We propose that microbial cells can aggregate as an ark for the interplanetary transfer of microbes, and we named it "massapanspermia".
松尾 陽一郎*; 泉 佳伸*; 長谷 純宏; 坂本 綾子; 野澤 樹; 鳴海 一成; 清水 喜久雄*
JAEA-Review 2012-046, JAEA Takasaki Annual Report 2011, P. 105, 2013/01
We have been studying ion beam-induced mutations in budding yeast S288c (
) as a model of eukaryote cell. We report a new method to evaluate DNA lesions caused by high-LET radiation using the polymerase chain reaction (PCR). PCR is one of the most reliable methods for detecting DNA damage as the amplification stops at the site of the damage. In this study, the 804-bp region of gene was amplified by PCR reaction using a specific oligonucleotide primer set. The PCR device adopted was an Eco Real-Time PCR System (Illumina). The percentage of undamaged template DNA was tended to decrease with an increase in absorbed dose of radiation. The higher LET radiations resulted in the higher rate of decrease in undamaged template DNA. This result suggests that different types of lesions are produced on DNA depending on the LET value of radiations.
仁宮 一章*; 野村 知世*; 佐藤 勝也; 鳴海 一成; 清水 宣明*
JAEA-Review 2012-046, JAEA Takasaki Annual Report 2011, P. 108, 2013/01
By using immunocytochemistry and fluorescence-activated cell sorter (FACS), yeast population highly expressing cellulase on the cell surface was enriched from the mutant population prepared by irradiation with carbon ion beams (220 MeV C, 100 Gy). Enzymatic activity of the enriched clones was quantified in vitro by a conventional biochemical method. Repeated FACS after irradiation with carbon ion beams was effective for selecting yeast population of interest.
松尾 陽一郎*; 泉 佳伸*; 長谷 純宏; 坂本 綾子; 野澤 樹; 鳴海 一成; 清水 喜久雄*
JAEA-Review 2011-043, JAEA Takasaki Annual Report 2010, P. 108, 2012/01
We have been studying ion-beam induced mutations in the budding yeast as a model of eukaryote cell. Yeast cells were irradiated with 220 MeV carbon ions with 107 keV/m LET. The survival rates following irradiation were determined on the basis of colony-forming ability. 
and 
strains showed hyper sensitivity, while the 
and 
strains showed relatively lower sensitivity to the carbon ion irradiation. The expression of 
gene was up-regulated following carbon ion irradiation but not rays. This difference may result from the repair pathway that operates in mutant strains.
仁宮 一章*; 曽田 裕司*; 佐藤 勝也; 鳴海 一成; 清水 宣明*
JAEA-Review 2011-043, JAEA Takasaki Annual Report 2010, P. 111, 2012/01
By using immunocytochemistry and fluorescence-activated cell sorter (FACS), yeast population highly expressing cellulase on the cell surface was enriched from the mutant population prepared by irradiation with carbon ion beams (220 MeV C, 100 Gy). Repeated FACS after irradiation with carbon ion beams was effective for selecting yeast population of interest.
仁宮 一章*; 曽田 裕司*; 佐藤 勝也; 鳴海 一成; 清水 宣明*
JAEA-Review 2010-065, JAEA Takasaki Annual Report 2009, P. 78, 2011/01
セルロース糖化酵素であるセルラーゼを発現する酵母を用いた"セルロースからの直接エタノール発酵生産"では、酵母のセルラーゼ発現量がバイオエタノール生産コストを下げるための律速段階の1つと言われている。本研究では、セルラーゼ高発現酵母を育種するために、イオンビームで突然変異を誘発した細胞表層に発現したセルラーゼの酵素量を蛍光免疫染色で蛍光強度に置き換えることにより、fluorescence-activated cell sorter(FACS)を用いて、セルラーゼ高発現株を蛍光強度の高い細胞集団としてhigh-throughputに分取することを目的とした。試験の結果、イオンビームによる変異誘発とFACS選抜を行った酵母のセルラーゼ活性を、親株と比較した結果、選抜された酵母集団のセルラーゼ活性は親株の3.25倍向上していることがわかった。
cells清水 喜久雄*; 松尾 陽一郎*; 泉 佳伸*; 長谷 純宏; 野澤 樹; 坂本 綾子; 鳴海 一成
JAEA-Review 2010-065, JAEA Takasaki Annual Report 2009, P. 79, 2011/01
To elucidate the molecular mechanism of mutagenesis caused by ion beam irradiation in yeast, two mutant strains and which are deficient in mismatch repair mechanisms were used to measure mutation spectra. Several hot spots were found in the mutant, while mutations in the mutant were distributed evenly for base substitution except one hot spot at position 345. These results suggest that the incorporation of damaged nucleotides was not uniform in yeast cells.
and mutants松尾 陽一郎*; 西嶋 茂宏*; 長谷 純宏; 野澤 樹; 坂本 綾子; 鳴海 一成; 清水 喜久雄*
JAEA-Review 2009-041, JAEA Takasaki Annual Report 2008, P. 75, 2009/12
本研究では、真核生物の一種である出芽酵母の野生株、塩基除去修復が不活性であるogg1株及びミスマッチ修復が不活性であるmsh2株を用いて、炭素イオンビーム照射で誘発される突然変異について、URA3遺伝子の突然変異を検出する5-FOAによる選択系で、変異スペクトルの解析を行った。その結果、野生株及びogg1株ともに塩基置換の頻度が高く、特にogg1株では変異のすべてが塩基置換であった。また、msh2株では、一塩基欠失が全体の突然変異の大部分を占め、その中でもGC to TAのトランスバージョン変異が多く誘発されることが確認された。これらの結果から、8-oxoGの生成がイオンビームに起因する突然変異をおもに誘導し、OGG1及びMSH2遺伝子が遺伝子の安定性に強く貢献していることが示唆された。
の微弱酵素活性の除去酒井 和哉*; 小林 弘幸*; 清水 仁聡*; 大島 章夫*; 加藤 重昭*; 佐藤 勝也; 鳴海 一成
JAEA-Review 2008-055, JAEA Takasaki Annual Report 2007, P. 85, 2008/11
接合菌の一種であるが菌体外に分泌する凝乳酵素(乳蛋白質の特定部分を分解するプロテアーゼの一種)はチーズ製造に広く使用されている。しかし、
は凝乳酵素を大量に生産する一方で異なる部位を分解するプロテアーゼ,油脂分解酵素のリパーゼ、及びアミラーゼなどチーズ製造には好ましくない少量の酵素を生産する。本研究では、イオンビームを用いた突然変異育種によって、このような夾雑酵素活性がない変異株を作出することである。オリーブ油を加えた寒天培地上に形成されるハロウを指標に、2株のリパーゼ低生産変異株を選抜した。得られた2株について、単胞子分離を行い安定した低生産性変異株の確立を試みたが、不安定な生産性を示すのみであった。一方、炭素イオンビーム照射により凝乳活性低下変異株を分離した。凝乳活性低下の原因を明らかにするため、液体培養後の菌体内と菌体外の酵素活性を比較したところ、生産株及び凝乳活性低下変異株ともに、菌体内1に対し菌体外5の比であり、菌体外への酵素の分泌には異常がないことがわかった。
高橋 真哉*; 中川 繭; 田中 淳; 鳴海 一成; 清水 喜久雄*; 坂本 綾子
JAEA-Review 2008-055, JAEA Takasaki Annual Report 2007, P. 58, 2008/11
植物の紫外線耐性機構の研究過程で、YファミリーDNAポリメラーゼをコードしている新規遺伝子
を同定した。YファミリーDNAポリメラーゼは複製忠実度が低く、さまざまなDNA損傷をバイパスすると考えられている。遺伝子欠損植物は、紫外線やDNA架橋剤に感受性を示す。遺伝子産物であるAtREV1タンパク質の生化学的な機能を解析するために、組換え大腸菌を用いてAtREV1タンパク質を発現・精製し、精製したタンパク質を用いてデオキシヌクレオチド転移活性を調べた。その結果、AtREV1タンパク質は複製忠実度が低く、鋳型の塩基にかかわらず、dCMPを好んで挿入することがわかった。また、APサイトの相補鎖には塩基を挿入できるが、紫外線損傷塩基の相補鎖には塩基を挿入できなかった。AtREV1タンパク質の低い複製忠実度が突然変異を引き起こすかどうかを調べるために、野生株と遺伝子欠損株の突然変異頻度を測定した。その結果、AtREV1タンパク質が紫外線あるいは線で生じるDNA損傷の誤複製を起こすことで、突然変異誘発を促進していることがわかった。
岡村 正愛*; 清水 明*; 大西 昇*; 長谷 純宏; 吉原 亮平; 鳴海 一成
JAEA-Review 2008-055, JAEA Takasaki Annual Report 2007, P. 62, 2008/11
本課題では、有用形質転換体へイオンビームを応用するシステムを開発することにより、さまざまな花色や形の品種をシリーズ化する手法を確立し、イオンビーム高度利用技術の開発に資することを目的とする。照射材料としては、分裂酵母由来の2本鎖RNA特異的RNA分解酵素(
)を導入することでキク発育阻害ウイロイド及びトマト黄化壊疽ウイルスに耐性を獲得した形質転換キクを用いた。これまでに炭素イオンビームの照射試験を実施し、順化,温室での栽培後、花色と花姿について調査した。照射によって得られた計832の個体について開花試験を行い、薄桃,濃桃,サーモン,白色,黄色などの花色変化を誘導できることを明らかにした。これらの結果から、この方法は、個々の遺伝子導入による従来法に比べて、低コストで高い品質の鑑賞植物の開発に有効であると考えられた。
松尾 陽一郎*; 西嶋 茂宏*; 長谷 純宏; 坂本 綾子; 鳴海 一成; 清水 喜久雄*
JAEA-Review 2008-055, JAEA Takasaki Annual Report 2007, P. 60, 2008/11
本研究は、真核生物のモデル生物である出芽酵母を用いて、イオンビームで生じる突然変異誘発の分子機構を解明することを目的とする。今回、野生株とDNAグリコシラーゼ活性の欠損によって8オキソデオキシグアニン(8-oxodG)を除去できない変異株を用いて、5-フルオロオロト酸耐性を指標として取得した
変異体を解析し、高LET炭素イオンビームによって生じる8-oxodGの突然変異誘発性を調べた。変異株の100Gy照射での変異の出現頻度は野生株の2倍であった。野生株では遺伝子に起こった突然変異のうちG
T塩基置換が全体の41%を占めていたのに対して、変異株ではGT塩基置換が全体の70%を占めていた。野生株では塩基置換のほかに挿入変異や欠損変異が認められたのに対して、変異株では挿入変異や欠損変異が認められなかった。
岡村 正愛*; 清水 明*; 渡辺 さとみ*; 長谷 純宏; 鳴海 一成; 田中 淳
JAEA-Review 2007-060, JAEA Takasaki Annual Report 2006, P. 82, 2008/03
本課題では、有用形質転換体へイオンビームを応用するシステムを開発することにより、さまざまな花色や形の品種をシリーズ化する手法を確立し、イオンビーム高度利用技術の開発に資することを目的とする。照射材料としては、分裂酵母由来の2本鎖RNA特異的RNA分解酵素()を導入することでキク発育阻害ウイロイド及びトマト黄化壊疽ウイルスに耐性を獲得した形質転換キクを用いた。これまでに炭素イオンビームの照射試験を実施し、順化,温室での栽培後、花色と花姿について調査した。3Gyから10Gyの炭素イオンビーム照射試験区では開花試験を行い、薄桃,濃桃,サーモンなどの花色変化を誘導できることを明らかにした。これらの結果から、この方法は、個々の遺伝子導入による従来法に比べて、低コストで高い品質の鑑賞植物の開発に有効であると考えられた。
