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論文

Structure of a highly acidic $$beta$$-lactamase from the moderate halophile ${it Chromohalobacter}$ sp.560 and the discovery of a Cs$$^{+}$$-selective binding site

新井 栄揮; 米澤 悌*; 岡崎 伸生*; 松本 富美子*; 柴崎 千枝; 清水 瑠美; 山田 貢*; 安達 基泰; 玉田 太郎; 河本 正秀*; et al.

Acta Crystallographica Section D, 71(3), p.541 - 554, 2015/03

 被引用回数:4 パーセンタイル:40.84(Biochemical Research Methods)

蛋白質を利用した希少・有害金属捕集材料の研究開発の一環として、中度好塩菌Chromohalobacter sp.560由来・高酸性$$beta$$-Lactamase(HaBLA)のX線結晶構造を解明するとともに、X線異常分散測定により、HaBLA分子上のCs$$^{+}$$, Sr$$^{2+}$$結合部位の抽出を試みた。PFのNW3AにてHaBLAのX線結晶構造を解明した後、Cs吸収端($$lambda$$=2.175${AA}$)近傍のX線を利用できるSAGA-LSのBL7やPFのBL17A、及び、Sr吸収端($$lambda$$=0.770${AA}$)近傍のX線を利用できるSPring-8のBL38B1やPFのBL5Aなどを使用して、HaBLA分子に結合したCs$$^{+}$$及びSr$$^{2+}$$を同定した。その結果、HaBLA分子上に少なくとも1ヶ所のCs$$^{+}$$結合部位、3ヶ所のSr$$^{2+}$$結合部位を発見した。特に、今回発見したCs$$^{+}$$結合部位は、Na$$^{+}$$がCs$$^{+}$$の9倍量存在する条件下(Na$$^{+}$$/Cs$$^{+}$$ = 90mM/10mM)でもCs$$^{+}$$を選択的に結合できることが明らかになった。このCs$$^{+}$$選択的結合部位は、Trp側鎖のベンゼン環によるカチオン-$$pi$$相互作用、および、主鎖の2つの酸素原子によってCs$$^{+}$$を結合していた。本研究で得たCs$$^{+}$$結合部位の立体構造情報は、原発事故によって放出された放射性Cs$$^{+}$$を捕集する蛋白質材料の設計(人工的Cs$$^{+}$$結合部位の設計)の土台として利用できる。

論文

Structural basis for acceptor-substrate recognition of UDP-glucose: anthocyanidin 3-${it O}$-glucosyltransferase from ${it Clitoria ternatea}$

廣本 武史; 本庄 栄二郎*; 野田 尚信*; 玉田 太郎; 数馬 恒平*; 鈴木 正彦*; Blaber, M.; 黒木 良太

Protein Science, 24(3), p.395 - 407, 2015/03

 被引用回数:38 パーセンタイル:85.24(Biochemistry & Molecular Biology)

チョウマメの花弁に含まれるUDP-glucose: anthocyanidin 3-${it O}$-glucosyltransferase(UGT78K6)は、UDP-glucoseを糖供与体とし、青色色素の基本骨格をなすデルフィニジンへの糖転移を触媒する酵素である。本酵素は、「フラボノール」に類似した化学構造を有するにもかかわらず、デルフィニジンなど「アントシアニジン」特異的な糖転移活性を示す。その糖受容体認識に関わる構造基盤を明らかにするため、UGT78K6単独の立体構造ならびに各糖受容体(アントシアニジンに分類されるデルフィニジンとペチュニジン、またフラボノールの一種であるケンフェロール)が結合した複合体の立体構造をX線結晶構造解析により決定した。今回の研究で見出された糖受容体の結合様式は、これまでに報告されている類似の糖転移酵素(赤ブドウ由来${it Vv}$GT1)とケンフェロールとの結合様式とは全く異なるものであり、発色の異なる糖受容体「アントシアニジン」と「フラボノール」をどのように識別しているのか、その分子メカニズムの解明を可能とした。今後、得られた構造情報を基に糖受容体との相互作用部位を改変することにより、色味の異なる色素化合物の合成あるいは医薬品候補分子の合成を可能にするものと期待される。

論文

Structural characteristics of alkaline phosphatase from the moderately halophilic bacterium ${it Halomonas}$ sp.593

新井 栄揮; 米澤 悌*; 石橋 松二郎*; 松本 富美子*; 安達 基泰; 玉田 太郎; 徳永 廣子*; Blaber, M.; 徳永 正雄*; 黒木 良太

Acta Crystallographica Section D, 70(3), p.811 - 820, 2014/03

 被引用回数:9 パーセンタイル:60.02(Biochemical Research Methods)

中度好塩菌${it Halomonas}$ sp.593のペリプラズム蛋白質Alkaline phosphatase(HaAP)は、他の好塩性Alkaline phosphataseと異なり、幅広い塩濃度域(1$$sim$$4M NaCl)において機能発現が可能である。そこで本研究では、HaAPの構造学的特徴と好塩性の関係を理解するために、HaAPのX線結晶解析を行った。分解能2.1${AA}$, 空間群${it P}$2$$_{1}$$, 格子定数${it a}$=52.7${AA}$, ${it b}$=147.0${AA}$, ${it c}$=58.3${AA}$, $$alpha$$=90$$^{circ}$$, $$beta$$=105.2$$^{circ}$$, $$gamma$$=90$$^{circ}$$, R$$_{merge}$$ 8.4%の回折データを取得して、生物学的構造単位であるHaAP二量体の立体構造を解明することに成功した。また、HaAPの立体構造を、PDB中で最も配列相同性が高い低度好塩菌${it Vibrio}$ sp.由来VAP(identity 70.0%)の立体構造と比較した。その結果、ASA$$>$$0${AA}$ $$^{2}$$の酸性アミノ酸(D, E)の数は、VAP(57個)よりもHaAP(72個)が多いことが明らかになった。また、VAPとHaAPを構成する疎水性アミノ酸(V, L, I, P, F, M, W)に着目すると、二量体界面に位置する疎水性アミノ酸の数はほぼ同じ(39個と40個)であったが、分子内部(ASAが0${AA}$)の疎水性アミノ酸はそれぞれ24個と37個であった。このようなHaAPにおける分子表面の高い酸性アミノ酸含量や分子内部の高い疎水性アミノ酸含量は、中度好塩菌のペリプラズム特有の幅広い塩濃度環境下(0.5M$$sim$$飽和塩濃度)における高い可溶性と機能発現の両立に寄与していると考えられる。

論文

Creation and structure determination of an artificial protein with three complete sequence repeats

安達 基泰; 清水 瑠美; 黒木 良太; Blaber, M.

Journal of Synchrotron Radiation, 20(6), p.953 - 957, 2013/11

 被引用回数:2 パーセンタイル:14.97(Instruments & Instrumentation)

Symfoil-4Pは、ヒト酸性繊維芽細胞増殖因子を基に設計した3回対称なベータトレフォイル構造をもつ人工タンパク質である。脱アミド反応を防ぐためにアスパラギン-グリシン配列を除去した変異体Symfoil-QGおよびSymfoil-SGを作製し、さらにSymfoil-QGにHisTagを付加したものをHis-Symfoil-IIとした。His-Symfoil-IIは、プロテアーゼ処理によりHisTagを除去することで、完全な3回繰り返し配列をもつことになる。各タンパク質は、大腸菌内で可溶性タンパク質として発現し、Niカラムにより精製した。Symfoil-IIについては、HisTagをプロテアーゼ処理により除去した後に陰イオン交換カラムを用いて精製した。Symfoil-QGとSymfoil-IIをそれぞれ、1.5および1.1${AA}$分解能で結晶構造解析した。精密化したSymfoil-IIは、他のSymfoilと同等に疑似3回軸を持っていることが示された。

論文

Structure and function of $$Delta$$1-tetrahydrocannabinolic acid (THCA) synthase, the enzyme controlling the psychoactivity of ${it Cannabis sativa}$

正山 祥生*; 玉田 太郎; 栗原 和男; 竹内 彩子*; 田浦 太志*; 新井 栄揮; Blaber, M.*; 正山 征洋*; 森元 聡*; 黒木 良太

Journal of Molecular Biology, 423(1), p.96 - 105, 2012/10

 被引用回数:64 パーセンタイル:87.97(Biochemistry & Molecular Biology)

$$Delta$$1-テトラヒドロカンナビノール酸(THCA)合成酵素は、基質であるカンナビゲロール酸の酸化的閉環反応を触媒し、大麻の幻覚活性をつかさどる$$Delta$$1-テトラヒドロカンナビノールの前駆体であるTHCAを合成する。本研究では、THCA合成酵素のX線結晶解析及び変異体を用いた活性測定を実施し、THCA合成酵素の機能-構造相関の解明を試みた。2.75${AA}$分解能で決定した立体構造情報に変異体解析結果を組合せことにより、THCA合成酵素の活性に寄与する残基を同定した。

論文

Substrate recognition mechanism of a glycosyltrehalose trehalohydrolase from ${it sulfolobus solfataricus}$ KM1

岡崎 伸生; 玉田 太郎; Feese, M. D.*; 加藤 優*; 三浦 裕*; 米田 俊浩*; 小林 和男*; 近藤 恵二*; Blaber, M.*; 黒木 良太

Protein Science, 21(4), p.539 - 552, 2012/04

 被引用回数:3 パーセンタイル:7.91(Biochemistry & Molecular Biology)

Glycosyltrehalose trehalohydrolase (GTHase) is an $$alpha$$-amylase that cleaves the $$alpha$$-1,4 bond adjacent to the $$alpha$$-1,1 bond of maltooligosyltrehalose to release trehalose. In order to investigate the catalytic and substrate recognition mechanisms of GTHase, two residues, Asp252 (nucleophile) and Glu283 (general acid/base), located at the catalytic site of GTHase were mutated (Asp252 $$rightarrow$$ Ser (D252S), Glu (D252E) and Glu283 $$rightarrow$$ Gln (E283Q)), and the activity and structure of the enzyme were investigated. The E283Q, D252E and D252S mutants showed only 0.04%, 0.03%, and 0.6% of enzymatic activity against the wild-type, respectively. The crystal structure of the E283Q mutant GTHase in complex with the substrate, maltotriosyltrehalose (G3-Tre), was determined to 2.6 ${AA}$ resolution. The structure with G3-Tre indicated that GTHase has at least five substrate binding subsites and that Glu283 is the catalytic acid, and Asp252 is the nucleophile that attacks the C1 carbon in the glycosidic linkage of G3-Tre. The complex structure also revealed a scheme for substrate recognition by GTHase. Substrate recognition involves two unique interactions: stacking of Tyr325 with the terminal glucose ring of the trehalose moiety and perpendicularly placement of Trp215 to the pyranose rings at the subsites -1 and +1 glucose.

論文

A Structural mechanism for dimeric to tetrameric oligomer conversion in ${it Halomonas}$ sp. nucleoside diphosphate kinase

新井 栄揮; 米澤 悌; 岡崎 伸生; 松本 富美子; 玉田 太郎; 徳永 廣子*; 石橋 松二郎*; Blaber, M.; 徳永 正雄*; 黒木 良太

Protein Science, 21(4), p.498 - 510, 2012/04

 被引用回数:15 パーセンタイル:39.86(Biochemistry & Molecular Biology)

さまざまな生物種で保存されているヌクレオシドニリン酸キナーゼ(NDK)は、4量体もしくは6量体構造を形成することが知られる。一方、中度好塩菌${it Halomonas}$ sp. 593由来NDK(HaNDK)はNDKとしては例外的に2量体を形成し、E134A変異導入により4量体へ変換される。本研究では、ゲルろ過光散乱及びX線結晶解析により、中度好塩菌${it Halomonas}$ sp. 593由来NDKにおけるE134A変異導入による多量体変換の機構を解明した。また、E134A変異型HaNDKの結晶中には、グラム陰性菌由来MxNDKに類似した4量体構造と大腸菌由来EcNDKに類似した4量体構造が交互に現れることを明らかにした。一般に蛋白質は会合することで熱安定性や基質親和性を増大することから、少ない変異導入による多量体構造の変化は、NDKがさまざまな環境に適合するために有効に寄与している可能性がある。

論文

Mutagenesis of the crystal contact of acidic fibroblast growth factor

本庄 栄二郎; 玉田 太郎; 安達 基泰; 黒木 良太; Meher, A.*; Blaber, M.*

Journal of Synchrotron Radiation, 15(3), p.285 - 287, 2008/05

 被引用回数:5 パーセンタイル:31.29(Instruments & Instrumentation)

われわれは薄板状にしか結晶化しないhaFGFの分子間接触部位を改善し結晶成長を制御することを試みている。haFGFのX線結晶構造から結晶学的に対称な位置関係にあるhaFGF分子の分子間接触部位にはGlu81の側鎖が近接して存在しており、この電荷の反発が分子間相互作用を乱している可能性が考えられた。このGlu81の側鎖が分子間相互作用に関与しているかどうかを調べるため、われわれはGlu81をAla, Val, Leu, Ser及びThrに置換したhaFGFの変異体を作成した。このGlu81の側鎖が分子間相互作用に関与しているかどうかを調べるため、われわれはGlu81をAla, Val, Leu, Ser及びThrに置換したhaFGFの変異体を作成した。それぞれの変異体について蟻酸を用いて結晶化を行ったところ、Ala, Val及びLeu変異体は野生型同様薄板状の結晶成長が見られたが、Ser及びThr変異体の結晶は野生型よりもより厚みが増していた。これらの変異体について1.5${AA}$分解能のX線構造を解いたところ分子間接触部位に存在するSerの水酸基が沈殿剤である蟻酸を介して水素結合を形成していることがわかった。このような分子間接触部位改変の試みは中性子結晶構造解析のための大型結晶育成に寄与すると考えられる。

口頭

中性子結晶構造解析を目的としたタンパク質工学によるヒト酸性FGF結晶の成長性の改変

安達 基泰; 本庄 栄二郎; 玉田 太郎; Blaber, M.*; 黒木 良太

no journal, , 

繊維芽細胞成長因子(FGF)は、細胞の増殖や分化を促進する因子であり、さまざまな生命活動に関与する多機能性分泌因子として注目されている。本研究では、ヒト酸性FGFの中性子構造解析によって全原子立体構造を明らかにし、ヒト酸性FGFの構造活性相関を解明することを目的とする。タンパク質を中性子構造解析するためには、体積の大きな結晶の作成が必要である。ヒト酸性FGFの結晶は1方向に薄い板状を示すので、分子接触面の改変により成長性の改変を試みた。X線結晶構造解析により既に得られているヒト酸性FGFの原子座標をもとに結晶内の分子パッキングを解析した結果、結晶のB軸方向に垂直な面において、分子間接触面積が小さく、しかも結晶学的対称軸付近で2つのGlu81の側鎖が隣接していた。そこでGlu81をAla, Val, Leu, Ser, Thr残基に置換したところ、Ser, Thrに置換した変異体において、より厚みを増した結晶が得られた。両変異体のX線結晶構造解析の結果、変異導入したSer及びThr側鎖のOH基が沈殿剤として使用している蟻酸を介して水素結合を形成していることが明らかとなった。

口頭

Development of Hydrogen and Hydration Database for Biomolecules (HHDB)

岡崎 伸生; 大原 高志; 海野 久雄*; 茶竹 俊行*; 栗原 和男; Cachau, R. E.*; Blaber, M.*; 新村 信雄*; 黒木 良太

no journal, , 

In protein molecules, key energetic contributors are solvation, desolvation and hydrogen bonding. They contribute protein folding, dynamics and molecular recognition. As a result, more elaborate studies of hydrogen atoms will be great help to recognize protein structures and obtain new findings of them. However, we do not have system which dedicated to characterization and analysis of hydrogen bonding. Therefore, we have developed a database for hydrogen and hydration water molecules. That database named Hydrogen and Hydration Database for Biomolecules (HHDB; http://hhdb.tokai-sc.jaea.go.jp/). Hydrogen bond data stored to HHDB use hydrogen atom coordinates determined directly by neutron diffraction and certain extremely high resolution X-ray diffraction. HHDB provides graphical user interface, users can use it through web browser. HHDB can visualize hydrogen atom positions in protein and solvent, and hydrogen bonding interactions. We are improving the web user interfaces and the performance for usability.

口頭

Development of hydrogen and hydration database for biomolecules (HHDB)

岡崎 伸生; 大原 高志; 海野 久雄*; 茶竹 俊行*; 栗原 和男; Cachau, R. E.*; Blaber, M.*; 新村 信雄*; 黒木 良太

no journal, , 

タンパク質分子において溶媒和や脱溶媒和、並びに水素結合は安定化に大きく影響し、それらはフォールディングやダイナミクス,分子認識に寄与している。したがって、水素原子の詳細な研究はタンパク質分子構造の認識やそれらから新たな知見を得る手段として重要であるが、水素結合の特性を解析するようなシステムはこれまで存在しなかった。そのようなシステムを構築するために、われわれは水素結合並びに水和水のためのデータベース(生体分子水素水和水データベース: HHDB)を開発した。HHDBは中性子結晶構造解析や超高分解能X線結晶構造解析によって決定された水素原子座標と、それらから導かれる水素結合のデータを保持している。HHDBはWebベースのグラフィカルユーザーインタフェース(GUI)を備え、利用者はWebブラウザを通してHHDBの機能を利用することができる、タンパク分子や溶媒分子などの水素原子座標や水素結合の状況を可視化することができる。Fig. 1は水素結合距離と結合角度をHHDBでプロットした例である。このプロットにおいて水素原子が原点に配置され、各点は水素結合受容体にあたり水素までの結合距離と共有結合との角度を示している。現在われわれは、これらのインタフェースの性能や利便性の向上を目指して改良を続けている。

口頭

三回繰り返し配列を有する人工タンパク質の創製とその結晶構造解析

清水 瑠美; 安達 基泰; 黒木 良太; Blaber, M.

no journal, , 

ヒト線維芽細胞増殖因子(hFGF)の立体構造情報をもとにして創製した、三回繰り返し配列を有する人工タンパク質(Symfoil)に関して、さらに高い分解能による立体構造情報の取得を目指している。今回、Symfoilの化学的に不安定な配列の除去と繰り返し配列の完全性の向上したSymfoil改変体(Symfoil-II)を設計した。Symfoil-IIは、大腸菌を用いて可溶性分画に発現させた後、Niキレートカラムにより精製し、さらにプロテアーゼ消化によってHisTagを除去したものを陰イオン交換HPLCにより精製した。その後Symfoilの二次構造形成を円偏光二色性スペクトルで確認した。精製試料の収量は、培地1Lあたり約15mgであった。精製したSymfoil-IIは、Symfoilと同様の結晶化条件(1.8M (NH$$_{4}$$)$$_{2}$$SO$$_{4}$$, 0.1M TrisHCl pH7.0)で結晶化した。実験室系のX線回折計による予備実験によって1.9${AA}$分解能の回折データを取得し、分子置換法で位相を決定した結果、Symfoilとは異なる結晶内分子パッキングを持つが、同様の高い対称性立体構造を有することがわかった。

口頭

Creation and structure determination of an artificial protein with three complete sequence repeats

安達 基泰; 清水 瑠美; 黒木 良太; Blaber, M.

no journal, , 

ヒト線維芽細胞増殖因子(hFGF)の立体構造情報をもとにして創製した、三回繰り返し配列を有する人工タンパク質(Symfoil)に関して、さらに高い分解能による立体構造情報の取得を目指している。今回、Symfoilの化学的に不安定な配列の除去と繰り返し配列の完全性の向上したSymfoil改変体(Symfoil-II)を設計した。Symfoil-IIは、大腸菌を用いて可溶性分画に発現させた後、Niキレートカラムにより精製し、さらにプロテアーゼ消化によってHisTagを除去したものを陰イオン交換HPLCにより精製した。その後Symfoilの二次構造形成を円偏光二色性スペクトルで確認した。精製試料の収量は、培地1Lあたり約15mgであった。精製したSymfoil-IIは、Symfoilと同様の結晶化条件(1.8M(NH$$_{4}$$)$$_{2}$$SO$$_{4}$$, 0.1M TrisHCl pH7.0)で結晶化した。実験室系のX線回折計による予備実験によって1.9${AA}$分解能の回折データを取得し、分子置換法で位相を決定した結果、Symfoilとは異なる結晶内分子パッキングを持つが、同様の高い対称性立体構造を有することがわかった。

口頭

Structural comparison of the substrate-binding mechanism between maltooligosyl trehalose synthase (MTSase) and maltooligosyl trehalose trehalohydrolase (MTHase)

安達 基泰; 岡崎 伸生*; 玉田 太郎; 加藤 優*; 小林 和男*; Blaber, M.; 黒木 良太

no journal, , 

マルトオリゴシルトレハロース合成酵素(MTSase)とマルトオリゴシルトレハローストレハロヒドロラーゼ(MTHase)は、食品の保存料として実用的な化合物であるトレハロースを効率的に生産するために鍵となる酵素である。今回、前者のMTSaseの触媒機構を理解するために、超高熱古細菌MTSaseのSulfolobus shibatae DSM5389由来のMTSaseのX線結晶構造を2.3${AA}$の分解能で決定した。その結果、($$beta$$/$$alpha$$)8ドメインに存在するAsp241, Glu269, Asp460の3つの残基が、関連酵素において普遍的に存在する触媒残基であることがわかった。

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