中性子結晶構造解析を目指したカゼインキナーゼIIの大型結晶作製

Preparation of large volume casein kinase-2 crystals for neutron diffraction experiment

柴崎 千枝; 安達 基泰; 清水 瑠美; 黒木 良太

Shibazaki, Chie; Adachi, Motoyasu; Shimizu, Rumi; Kuroki, Ryota

カゼインキナーゼは、細胞に広く存在するセリン/スレオニンキナーゼであり、その一つであるカゼインキナーゼII(CK2)は、細胞周期の進行や細胞の生存・増殖に関与することが知られている。またCK2の過剰な発現は、発癌や癌転移との関係が指摘されている。CK2の阻害剤開発において有効な立体構造的知見を得るため、我々はCK2のキナーゼ触媒サブユニット(CK2)の中性子構造解析を目指している。大腸菌にて過剰発現させたCK2をカラムクロマトグラフィーによって精製し、大型結晶の作製を試みた。大型結晶の作製にはマクロシーディング法を用い、約40mg/mLに濃縮したタンパク質試料に種結晶を加えることによって実施した。その結果、最終的に約2mmの大型結晶を得ることができた。取得した結晶を、重水および重水素化試薬を用いて作製した結晶保存溶液で透析し、ミュンヘン工科大学の研究用原子炉(FRM-II)中性子ビームライン(BioDIFF)において、予備的中性子回折実験を実施した。結晶を100Kに冷却し、約30分間の照射を行うことによって、1.9分解能を超える回折点の観測に成功した。今後、取得した結晶を用いた中性子回折実験を実施し、CK2の詳細な構造解析を実施する予定である。

Casein kinase 2(CK2) is one of the ubiquitous Ser/Thr kinases and is involved in the cell cycle and the survival and proliferation of cells. CK2 is a heterotetrameric structure comprising two - or -subunits. In order to understand the biological function of the alpha catalytic subunit of CK2 (CK2), we aim to analyze the structure of CK2 including information of the hydrogen and hydrating water molecule by neutron crystallography. The gene coding CK2 was inserted into pET24a and expressed in . coli strain BL21DE3, in which the mobile region (330-335) and chemically reactive thiols (Cys147 and Cys220) were removed by amino acid mutation. A total of 150 mg protein was obtained from a 6 L culture, and was used for crystallization trials. The preparation of large crystals was performed using a macro seeding method. Finally, a large crystal with a volume of approximately 2 mm was reproducibly obtained. The crystal was dialyzed in the deuterated reagent and deuterium water, and the preliminary neutron diffraction experiments were carried out at neutron beam line BioDIFF in research reactor FRM-II in Technical University of Munich. The diffraction was successfully observed greater than 1.9 resolution.