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gene in rice via targeted mutagenesis using the CRISPR/Cas9 system雑賀 啓明*; 三上 雅史*; 遠藤 真咲*; 坂本 綾子; 土岐 精一*
JAEA-Review 2015-022, JAEA Takasaki Annual Report 2014, P. 97, 2016/02
Arabidopsis thaliana cells, in which DNA double-strand breaks (DSBs) have occurred, select either DNA repair, cell death or endocycle. Avoidance of entry into endocycle even under genotoxic conditions, rice (Oryza sativa L.) is more suitable than Arabidopsis for the study of DSBs repair in plants. Nijmegen breakage syndrome 1 (NBS1) protein consists of the Mre11/Rad50/NBS1 (MRN) complex plays an important role in response to DNA damage in mammal. Although rice has a homologue of NBS1, OsNBS1, its function remains unclear. Here, we attempted to knockout the OsNBS1 gene using the recently developed clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)-associated endonuclease 9 (CRISPR/Cas9) system. Rice (cv. Nipponbare) cells were transformed via Agrobacterium and obtained 72 lines of cali. Cleaved amplified polymorphic sequences (CAPS) analysis detected mutations in 58 lines. Biallelic mutations in theOsNBS1 gene were induced in 24 lines. Sequence analyses of PCR products in #2 and #4 detected not only small mutations but also large modifications at the expected cleavage site. The large insertions involved one or two fragments that seem to be copied from sequences around the cleavage site. These mutations are thought to be repaired by a synthesis-dependent strand annealing (SDSA)-like system as proposed in a previous report in barley.
高野 成央*; 高橋 祐子*; 山本 充*; 寺西 美佳*; 山口 弘子*; 坂本 綾子; 長谷 純宏; 藤澤 弘子*; Wu, J.*; 松本 隆*; et al.
Journal of Radiation Research, 54(4), p.637 - 648, 2013/07
被引用回数：13 パーセンタイル：50.15(Biology)UVB radiation suppresses photosynthesis and protein biosynthesis in plants, which in turn decreases growth and productivity. Here, an ultraviolet-B (UVB)-tolerant rice mutant, 
(
), was isolated from a mutagenized population derived from 2,500 M1 seeds that were exposed to carbon ions. The mutant was more tolerant to UVB than the wild type. Neither the levels of UVB-induced CPDs, nor the repair of cyclobutane pyrimidine dimers or (6-4) pyrimidine-pyrimidone photodimers was altered in the mutant. Thus, the mutant may be impaired in the production of a previously unidentified factor that confers UVB tolerance. To identify the mutated region in the mutant, microarray-based comparative genomic hybridization analysis was performed. Two adjacent genes on chromosome 7were predicted to represent the mutant allele. Sequence analysis of the chromosome region in revealed a deletion of 45,419 bp. Database analysis indicated that the Os07g0265100 gene, 
, encodes a putative protein with unknown characteristics or function. In addition, the homologs of UTR319 are conserved only among land plants. Therefore, is a novel UVB-tolerant rice mutant and UTR319 may be crucial for the determination of UVB sensitivity in rice, although the function of UTR319 has not yet been determined.
雑賀 啓明*; 吉原 亮平*; 坂本 綾子; 土岐 精一*
JAEA-Review 2012-046, JAEA Takasaki Annual Report 2011, P. 99, 2013/01
To date, many commercial varieties of various kinds of plants have been developed by ion beam breeding. However, to further improve the ion beam breeding system, it is important to gather more basic information on the mutagenic effects of ion beams in plants. To this end, we try to establish a novel mutation detection system using a conditional negative selection marker to stop cell growth. Cultured cell such as callus that can clonally propagate efficiently and easily are well-suited to this system. In this study, we checked the sensitivity of callus of the model plants Arabidopsis and rice to carbon ion beams.
吉原 亮平; 野澤 樹; 雑賀 啓明*; 寺西 美佳*; 土岐 精一*; 日出間 純*; 坂本 綾子
JAEA-Review 2010-065, JAEA Takasaki Annual Report 2009, P. 74, 2011/01
This study aimed to elucidate the effects of ion beams on . We focus on (1) what kinds of damage are produced by ion beams, and (2) what kinds of cellular processes are involved in turn the damage into mutations. Our results suggest that 220 MeV carbon ions may induce more numbers of DNA lesions or more severe types of DNA lesions than 
-rays and 50 MeV helium ions. Our results also suggest that the considerable amount of DNA lesions induced by -rays and 50 MeV helium ions are repaired by non-homologous end-joining (NHEJ) repair mechanism, but the majority of DNA lesions induced by 220 MeV carbon ions are not repaired by NHEJ.
高野 成央*; 山本 充*; 高橋 祐子*; 寺西 美佳*; 坂本 綾子; 長谷 純宏; 田中 淳; Wu, J.*; 松本 隆*; 土岐 精一*; et al.
no journal, ,
成層圏オゾン層の破壊に伴うUVB量の増加は、穀物の生産量に影響を及ぼすことが危惧されている。われわれは、植物におけるUVB耐性機構の全容を明らかにするため、UVB抵抗性品種ササニシキに炭素イオンビームを照射し、UVB耐性もしくは感受性を示す変異体の作出を試みた。約6000系統の照射当代から得られた自殖後代に対してRoot bending assay法による選抜とUVB付加条件下での生育検定を行った結果、UVB耐性変異体を2系統、UVB感受性系統を3系統得ることに成功した。このなかでUVB耐性を示すUVTSa-319、UVB感受性を示すUVSSa-1のゲノムDNAを用いてComparative Genomic Hybridization(CGH)解析を行い、各変異体で欠失している染色体部位を同定した。その結果、UVTSa-319ではイネ第7染色体の約45kbが、またUVSSa-1でも同じく第7染色体の52kbがそれぞれ欠失していることが明らかとなった。現在、これら欠失した遺伝子の機能とUVB耐性、もしくは感受性との関連について解析を進めている。
雑賀 啓明*; 吉原 亮平; 坂本 綾子; 土岐 精一*
no journal, ,
突然変異は、イオンビーム照射によって誘発されるDNA損傷が正確に修復されなかった結果として生じる。よって、イオンビームの照射によって生じる突然変異のスペクトラムと、その原因となるDNA損傷修復機構との関係が明らかになれば、突然変異スペクトラムを制御できると考えられる。われわれは、DNA損傷と変異スペクトラムの関係を明らかにするために、モデル植物であるシロイヌナズナやイネのカルスを用いて新規の突然変異スペクトラム解析実験系の構築を試みた。シロイヌナズナの葉及び根から誘導したカルスを用いてイオンビームに対する感受性を調べたところ、7.5Gyより高い線量を照射した場合では、シュートの再生効率が10%未満に低下することが明らかとなった。一方、イネカルスを用いた感受性試験では、照射していないカルスや2.5-15Gyのイオンビームを照射したカルスの新鮮重は30-35mgであったのに対し、20-40Gyの高い線量を照射したカルスでは15-20mgとなり、増殖が抑制されていることが明らかとなった。今後は、これらの条件を参考に変異スペクトラム解析実験系を構築し、イオンビームによって誘発される突然変異のスペクトラム解析を行うとともに、その誘発にかかわるDNA修復機構の解析を行いたいと考えている。
日出間 純*; 寺西 美佳*; 土岐 精一*; 雑賀 啓明*; 坂本 綾子; 吉原 亮平
no journal, ,
イオンビームを用いた植物の突然変異誘発の研究は、原子力機構が研究拠点となり、高崎量子応用研究所のイオン照射装置(TIARA)を利用して、世界に先駆けて行われてきた。イオンビームによる突然変異体育種の特徴として、(1)低LET放射線と比較して、突然変異誘発率が高く、変異スペクトラムが広いこと、(2)1つの形質のみに変異が生じ、変異形質が安定している、等が知られている。しかし、従来の方法と同様に、イオンビーム育種においても突然変異の方向性はランダムかつ偶発的であり、また多大な労力が必要とされるため、より有効な技術が望まれていた。本研究では、モデル植物を利用して、さまざまなDNA修復系とそれが関与する突然変異スペクトラムとの関係を明らかにすることにより、これまでランダムで偶発的と考えられてきた突然変異の誘発に関して、その誘発機構を制御することにより、より効率的な育種素材を創成することを目指している。
寺西 美佳*; 日出間 純*; 雑賀 啓明*; 土岐 精一*; 吉原 亮平*; 野澤 樹; 長谷 純宏; 坂本 綾子
no journal, ,
これまで「突然変異は偶発的に生じる」という立場から、目的の変異体獲得のためには最適な選抜条件の設定と選抜規模の拡大が必須とされてきた。しかし、「突然変異はDNA損傷に対して細胞内での修復機構が作用することで生じる」という点に着目すると、細胞内でのDNA修復機構を人為的に制御できれば、より自由に突然変異の効率や方向性をデザインできる可能性がある。そこで、このような新技術の開発のための第一歩として、シロイヌナズナのDNA修復欠損株を作製し、イオンビーム誘発変異における幾つかのDNA修復機構の果たす役割の解明を試みた。
坂本 綾子; 秋田 睦; 遠藤 真咲*; 土岐 精一*
no journal, ,
AtPol
, AtPol
およびAtRev1は真核生物で保存されている損傷乗り越え型DNAポリメラーゼのシロイヌナズナにおけるホモログであるが、これらを欠失させると紫外線によって生長が抑制されることから、植物の紫外線応答において重要な役割を果たすことが示唆されている。GUS遺伝子をマーカーとした復帰突然変異検出実験では、AtPolやAtRev1を欠損すると紫外線誘発突然変異頻度が大きく減少する一方で、AtPolを欠失すると突然変異頻度が上昇した。このことから、AtPolやAtRev1は紫外線損傷を乗り越える際にエラーを起こしやすいのに対し、AtPolはエラーを起こしにくいことが予想された。一方で、AtRev1は他のポリメラーゼのサブユニットやPCNAなどの複製装置蛋白質と相互作用することから、紫外線応答で必要な蛋白質を複製フォークに呼び込む機能を持つことが示唆されている。今回、我々は相同組換えマーカーを組み込んだシロイヌナズナを用い、AtPolまたはAtRev1を欠失させた際に相同組換え頻度が変化するかどうかを解析した。その結果、AtRev1を欠失すると組換え頻度が一様に減少したが、AtPolを欠失させると一部のマーカーでのみ相同組換え頻度が上昇するという結果が見られた。このことから、AtPolとAtRev1は相同組換えの制御において異なる機能を持つことが示唆された。さらに、損傷乗り越え複製型ポリメラーゼが植物のゲノム安定性維持に関わる様々な機能に関与する可能性が示された。
線の植物の相同組換え活性に及ぼす効果坂本 綾子; 土岐 精一*; 日出間 純*
no journal, ,
イオンビームによって生じるDNA損傷は、修復の困難なクラスター損傷やDNA二本鎖切断が多いことが知られており、これらを修復するために誤りがちな修復機構である非相同末端結合(NHEJ)の経路が利用されると考えられている。しかし、植物のDNA修復機構にはこの他にも相同組換え(HR)などの経路があり、イオンビームを照射したときにどのようなメカニズムで修復が起こっているのかは明らかでない。そこで本研究では、HRの活性を検出する遺伝子マーカーを組み込んだシロイヌナズナを用い、線およびイオンビーム照射によってこれらの活性が上昇するかどうかを解析した。一部が重複・分断した大腸菌
グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子が挿入されたシロイヌナズナに対して15-25Gyの107MeV 
He
または25Gyの線照射を行い、地上部のみを回収しGUS染色を行った。その結果、25Gyの線照射でもわずかに組換え活性の上昇が見られたが、25GyのHeではより強いHR活性の誘導が検出された。15GyのHeでは、25Gyの線と同程度のHR活性が検出された。このことから、Heは、同線量の線よりもHRを誘導する活性が高いことが明らかになった。
玉置 雅紀*; 坂本 綾子; 遠藤 真咲*; 土岐 精一*
no journal, ,
東日本大震災により伴う福島第一原子力発電所事故により、福島県の浜通りを中心に放射性物質による広域な土壌汚染が引き起こされた。放射性物質による土壌汚染はこれまでの重金属等による汚染とは異なり、放射線を放出することによりDNAへの損傷さらには突然変異を誘発する恐れが懸念される。本研究では福島における放射性物質汚染土壌が植物にどのような影響を与えるのかについてGU-USを導入した遺伝子組換えシロイヌナズナを用いて評価を行った。GU-USコンストラクトが導入されたシロイヌナズナ4系統#11, #651, #1406及び#1415を用いて5Gy/hの線を10時間照射したところ、すべての系統において遺伝子修復に伴うGUSスポットの増加が認められた。そこで、これらの植物を空間線量の異なる福島県内各地より採取した土壌を用いて栽培を行った。用いた土壌の
Cs濃度は、73kBq/kg(高濃度), 34kBq/kg(中濃度)及び5kBq/kg(低濃度)であった。また非汚染土壌での栽培も行った。これらの土壌で30日間栽培を行った後にGUS染色を行った結果、すべての系統において汚染土壌でのGUSスポットの増加が認められた。さらに#1406系統では土壌のCs濃度依存的なGUSスポットの増加が確認された。また、このGUSスポットは外部被曝によることが示された。汚染土壌で栽培した植物体では発芽率の低下は見られなかったが、活性酸素のスーパーオキサイドの生成量の増加が認められた。
