Preliminary neutron diffraction studies of NADH-cytochrome reductase at J-PARC

J-PARCにおけるNADH-シトクロム還元酵素の予備的中性子回折実験

平野 優; 山田 貢*; 栗原 和男; 日下 勝弘*; 木村 成伸*; 三木 邦夫*; 玉田 太郎

Hirano, Yu; Yamada, Mitsugu*; Kurihara, Kazuo; Kusaka, Katsuhiro*; Kimura, Shigenobu*; Miki, Kunio*; Tamada, Taro

NADH-シトクロム還元酵素(b5R)はフラボタンパク質の1つで、その酸化還元反応に伴いチトクロム等の電子受容体に電子を伝達するが、この反応は小胞体における薬物代謝や脂質合成に深く関与することが知られている。これまでに実施した酸化型および還元型b5RのX線結晶解析の結果から、b5Rの酸化還元サイクルの理解が深まったが、電子授受にかかわる補因子(FAD)や周辺のアミノ酸側鎖の水素原子を含む詳細な構造を決定するには至っていない。そこで、水素原子の直接観察にたけた中性子を用いたb5Rの結晶構造解析に着手した。中性子回折実験のために、2mmを超える大型結晶を作成し、それを段階的に抗凍結溶液に浸漬することにより、低温下での中性子回折実験を実現した。J-PARC/MLFのBL03(iBIX)において14時間照射(加速器出力: 300kW)した結果、1.4分解能の回折点を確認することができた。2014A期には中性子結晶解析のためのフルデータ収集を予定している。

NADH-cytochrome reductase (b5R), a flavoprotein consisting of NADH- and FAD-domains, catalyzes electron transfer from the two-electron carrier NADH to the one-electron carrier cytochrome . The reaction catalyzed by b5R plays a role in fatty acid synthesis, cholesterol synthesis, and xenobiotic oxidation as a member of the electron transport chain on the endoplasmic reticulum. We have already determined the crystal structures of both the fully reduced and oxidized forms of porcine liver b5R by X-ray crystallography, but, its detail mechanism, especially hydride/proton transfers and exact states of semiquinone, still remains unknown. The hydrogen information obtained by neutron crystallography will be essential for the real understanding of catalytic cycle of the b5R. For neutron diffraction experiments, we prepared large crystals with the size of almost 2 mm. Large crystals were transferred to cryo-protectant solution by stepwise soaking method, and then were flash-frozen in a cold nitrogen gas stream. In preliminary neutron experiment, we confirmed some diffraction spots above 1.4 , resolution from a crystal with the size of 1.8 mm under 100 K at BL03 (iBIX), MLF, J-PARC after 14 hours exposure at 300 KW accelerator power.