Structural and functional differentiation of each subunit in dimeric HIV-1 protease by single-chain derivatization

2量体HIV-1プロテアーゼにおける各サブユニットの構造・機能的解析のための一本鎖化

安達 基泰; 柴崎 千枝; 新井 栄揮; 清水 瑠美; 黒木 良太

Adachi, Motoyasu; Shibazaki, Chie; Arai, Shigeki; Shimizu, Rumi; Kuroki, Ryota

HIV-1プロテアーゼ(HIV-PR)は、エイズ治療のための創薬標的タンパク質である。本研究では、2量体HIV-1プロテアーゼにおける各サブユニットを区別して、構造・機能的解析を行い、量子ビームの応用によって阻害剤結合機構を詳細に明らかにすることを目的とする。今回、プロトマー間でN及びC末端が隣接することに着目し、タンデムに結合した遺伝子間に2アミノ酸残基分のリンカー配列を挿入することで、一本鎖化HIV-PRの作製を試みた。一本鎖化HIV-PRは、野生型と同様に大腸菌内に封入体として発現した。リフォールディングした一本鎖化HIV-PRを精製し、KNI-272との複合体を結晶化した。得られた結晶を用いて、放射光施設(SPring-8)にて1.3分解能の回折データを収集し、R値19%まで構造を精密化した。一本鎖化HIV-PRの立体構造は、野生型とほとんど同じ(RMSD[Calpha]=0.17)であった。この結果は、導入したリンカーが、HIV-PRの全体構造に影響を与えていないことを示しており、一本鎖化が成功したことを示す。

HIV protease-I (HIV-PR) is an important drug target protein for AIDS. Since HIV-PR has a homo dimeric structure, the contribution of each monomer on its structure and function is indistinguishable. To solve this problem, a single chain derivative of HIV-PR (sc-HIV-PR) was designed. The gene coding sc-HIV-PR, in which a linker comprising glycyl-analine was placed between the C-terminal and N-terminal of each HIV-PR, was expressed in E. coli. The inactive form in inclusion bodies was successfully refolded to its active form as reported previously. The tertiary structure of sc-HIV-PR with KNI272 was determined to 1.3 resolution by X-ray crystallography. The structure of scHIV-PR was confirmed to be essentially equivalent to the original dimer form of HIV-PR with a RMSD of less than 0.3 including the structure of active site. This result indicates that the single chain derivatization of HIV-PR was successful and the inserted linker did not affect the overall structure of HIV-PR.