Preparation of large-volume crystals for structure analysis of human casein kinase-2 by neutron crystallography

ヒトカゼインキナーゼIIの中性子結晶構造解析を目的とした大型結晶作製

柴崎 千枝; 安達 基泰; 廣本 武史; 清水 瑠美; 黒木 良太

Shibazaki, Chie; Adachi, Motoyasu; Hiromoto, Takeshi; Shimizu, Rumi; Kuroki, Ryota

細胞に広く存在するセリン/スレオニンキナーゼであるカゼインキナーゼII(CK2)は、2つのサブユニットと2つのサブユニットからなる4量体構造を有しており、細胞周期の進行や細胞の生存・増殖に関与することが知られている。CK2の生物学的機能を理解するために、我々は、中性子結晶構造解析を用いて、CK2の水素原子や水和水の情報を含む蛋白質構造を明らかにすることを目指している。大腸菌にて過剰発現させたCK2をカラムクロマトグラフィーによって精製し、得た蛋白質を用いて大型結晶の作製を試みた。大型結晶の作製にはマクロシーディング法を用い、40mg/mLの蛋白質溶液と同量の沈殿剤溶液(25mM Tris-HCl(pH8.5)、0.85M硫酸アンモニウム、1mM DTTおよび5%アセトニトリル)を混ぜた後、種結晶を添加した。その後、リザーバー溶液の硫酸アンモニウムの濃度を数日間かけて1.2Mまで上昇させた。その結果、子結晶の形成が抑えられ、最終的に約2mmの大型単結晶を得ることができた。取得した結晶を中性子実験と同一の条件(重水および重水素化試薬を用いて作製した結晶保存溶液)で透析し、X線回折実験を行った。その結果、100Kで1.1の分解能の回折像を得ることができた。今後、作製した大型結晶を用いて中性子回折実験を実施し、CK2の詳細な構造解析を実施する予定である。

Casein kinase 2 (CK2) is one of the ubiquitous Ser/Thr kinases and is involved in the cell cycle and the survival and proliferation of cells. CK2 is a heterotetrameric structure comprising two - or -subunits and two regulatory -subunits. In order to understand the biological function of the alpha catalytic subunit of CK2, we aim to analyze the structure of CK2 including information of the hydrogen and hydrating water molecule by neutron crystallography. The gene coding CK2 was inserted into pET24a and expressed in E. coli strain BL21DE3, in which the mobile region and chemically reactive thiols were removed by amino acid mutation. A total of 150 mg protein was obtained from a 6 L culture, and was used for crystallization trials. The preparation of large crystals was performed using a macro seeding method specially developed for CK2. Finally, a large crystal with a volume of approximately 2 mm was reproducibly obtained. From the X-ray diffraction study, we confirmed that the crystals obtained diffracted to approx. 1 resolution at 100 K after soaking the crystal into the deuterated cryo protectant. The neutron diffraction data collection is planned to obtain a high resolution neutron structure of CK2.