中性子結晶構造解析を目指したカゼインキナーゼIIの大型結晶作製

Preparation of large volume casein kinase-2 crystals for neutron diffraction experiment

柴崎 千枝; 安達 基泰; 廣本 武史; 清水 瑠美; 黒木 良太

Shibazaki, Chie; Adachi, Motoyasu; Hiromoto, Takeshi; Shimizu, Rumi; Kuroki, Ryota

カゼインキナーゼ(CK2)は、その過剰な発現と、発癌や癌転移との関係が指摘されていることから、創薬標的タンパク質の一つとなっている。我々は、CK2の中性子結晶構造解析によって、阻害剤開発に有効な水素・水和構造に関する立体構造的知見を得ることを目的として、大型結晶作製と予備的中性子回折実験を実施した。大腸菌にて過剰発現させたCK2a(触媒サブユニットのみ)をカラムクロマトグラフィーによって精製し、大型結晶の作製を試みた。CK2の阻害剤であるEmodinとCX-4945との複合体試料について、約40mg/mLに濃縮したタンパク質試料に種結晶を加えることによって、約2mmの大型結晶を得ることができた。取得した結晶を、重水および重水素化試薬を用いて作製した溶液に対して透析処理した後、ミュンヘン工科大学の研究用原子炉(FRM-II)に設置の中性子回折計(BioDIFF)を用いて、予備的中性子回折実験を実施した。結晶を100Kに冷却し、約30分間照射した結果、阻害剤非結合型、Emodin複合体、CX-4945複合体についてそれぞれ、1.9, 2.0, 1.8の分解能を示す回折点の観測に成功した。

Casein kinase 2(CK2) is one of the ubiquitous Ser/Thr kinases and is involved in the cell cycle and the survival and proliferation of cells. In order to understand the biological function of the alpha catalytic subunit of CK2 (CK2a), we aim to analyze the structure of CK2a including information of the hydrogen and hydrating water molecule by neutron crystallography. The gene coding CK2a was expressed in E. coli, in which the mobile region and chemically reactive thiols were removed by amino acid mutation. The preparation of large crystals with inhibitor (Emodin and CX4945) was performed using a macro seeding method. Finally, large crystals with a volume of approximately 2 mm were reproducibly obtained. The crystals were dialyzed in the deuterated reagent and deuterium water. We have collected high resolution neutron diffraction images of emodin complex and CX-4945 complex at neutron beam line BioDIFF (FRM-II, Munich).