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平田 芳信*; 中川 洋; 山内 宏樹; 金子 耕士; 萩原 雅人; 山口 秀幸*; 大元 智絵*; 勝野 那嘉子*; 今泉 鉄平*; 西津 貴久*
Food Hydrocolloids, 141, p.108728_1 - 108728_7, 2023/08
被引用回数：2 パーセンタイル：70.62(Chemistry, Applied)結晶化度は食品や材料の機械的性質に反映される。結晶化度は澱粉の構造ダイナミクスと関係しているはずである。本研究では、中性子準弾性散乱(QENS)を用いて、炊飯澱粉の老化に伴う分子ダイナミクスの変化を調べた。測定されたQENSの幅は老化に伴い狭くなった。また、弾性非干渉散乱構造因子(EISF)は増加し、老化現象に伴い分子ダイナミクスが空間的に抑制されることが示された。低移動度と高移動度をそれぞれ結晶相と非晶質相に対応させた2値分布の連続拡散モデルを用いてEISFを解析したところ、低移動度成分の割合が老化によって増加することが示された。
廣本 武史; 安達 基泰; 柴崎 千枝; Schrader, T. E.*; Ostermann, A.*; 黒木 良太
JPS Conference Proceedings (Internet), 8, p.033003_1 - 033003_6, 2015/09
T4ファージリゾチーム(T4L)は、大腸菌の細胞壁を構成するムラミルペプチドを加水分解し、溶菌を引き起こす酵素である。野生型T4Lは、加水分解後の生成物のアノマー構造を逆転する酵素であるが、26番目のThr残基を部位特異的にHis残基に置換したT26H変異型T4Lは、加水分解生成物のアノマー構造を保持する酵素に変換されるのみならず、高い糖転移活性を獲得する。そこで、変異型酵素に導入したHis残基の糖転移反応における役割と隣接する酸性残基(Asp20)との関係を中性子構造解析によって明らかにするため、T26H変異型T4Lの完全重水素化とその大型結晶作製を試みた。完全重水素化タンパク質(d-T26H)は、一般的な大腸菌発現ベクターを用い、完全重水素化培地で組換え大腸菌を培養後、過剰発現させることによって調製した。精製試料を用いて、タンパク質濃度と沈殿剤濃度を変化させたスクリーニングを実施し、約0.12mm
の結晶を取得した。本結晶をミュンヘン工科大学の研究用原子炉(FRM II)において極低温下(100K)での予備的中性子回折実験を実施した結果、2.8
分解能を超える回折点の観測に成功した。
廣本 武史; 安達 基泰; 柴崎 千枝; 黒木 良太
no journal, ,
T4ファージリゾチーム(T4L)は、大腸菌の細胞壁を構成するムラミルペプチドを加水分解し、溶菌を引き起こす酵素である。野生型T4Lは、加水分解後の生成物のアノマー構造を逆転する酵素であるが、26番目のThr残基を部位特異的にHis残基に置換したT26H変異型酵素は、加水分解生成物のアノマー構造を保持する酵素に変換されるのみならず、高い糖転移活性を獲得する。一般に糖加水分解酵素では、酸性残基の2つのカルボン酸がそれぞれ酸および塩基触媒として関与するが、T26H変異型酵素ではカルボン酸の代わりにヒスチジン側鎖が反応に関与する。そこで、変異型酵素に導入したHis残基の糖転移反応における役割と隣接する酸性残基(Asp20)との関係を中性子構造解析によって明らかにするため、野生型およびT26H変異型T4Lの完全重水素化とその大型結晶作製を試みたので報告する。それぞれの完全重水素化タンパク質は、一般的な大腸菌発現ベクター(pET-24a)を用い、完全重水素化培地で組換え大腸菌を培養後、過剰発現させることによって調製した。取得した試料を用いて、タンパク質濃度と沈殿剤濃度を変化させたスクリーニングを実施し、約0.1mmの結晶を取得した。本結晶をミュンヘン工科大学(FRM-II)において極低温下(100K)での予備的中性子回折実験を実施した結果、小型の結晶ではあるが2.5分解能を超える回折点の観測に成功した。
柴崎 千枝; 安達 基泰; 廣本 武史; 清水 瑠美; 黒木 良太
no journal, ,
細胞に広く存在するセリン/スレオニンキナーゼであるカゼインキナーゼII(CK2)は、2つの
サブユニットと2つの
サブユニットからなる4量体構造を有しており、細胞周期の進行や細胞の生存・増殖に関与することが知られている。CK2の生物学的機能を理解するために、我々は、中性子結晶構造解析を用いて、CK2の水素原子や水和水の情報を含む蛋白質構造を明らかにすることを目指している。大腸菌にて過剰発現させたCK2をカラムクロマトグラフィーによって精製し、得た蛋白質を用いて大型結晶の作製を試みた。大型結晶の作製にはマクロシーディング法を用い、40mg/mLの蛋白質溶液と同量の沈殿剤溶液(25mM Tris-HCl(pH8.5)、0.85M硫酸アンモニウム、1mM DTTおよび5%アセトニトリル)を混ぜた後、種結晶を添加した。その後、リザーバー溶液の硫酸アンモニウムの濃度を数日間かけて1.2Mまで上昇させた。その結果、子結晶の形成が抑えられ、最終的に約2mmの大型単結晶を得ることができた。取得した結晶を中性子実験と同一の条件(重水および重水素化試薬を用いて作製した結晶保存溶液)で透析し、X線回折実験を行った。その結果、100Kで1.1の分解能の回折像を得ることができた。今後、作製した大型結晶を用いて中性子回折実験を実施し、CK2の詳細な構造解析を実施する予定である。
清水 瑠美; 廣本 武史; 安達 基泰; 柴崎 千枝; 黒木 良太
no journal, ,
T4ファージリゾチーム(T4L)は、大腸菌の細胞壁を構成するムラミルペプチドを加水分解し、溶菌を引き起こす酵素である。野生型T4Lは、加水分解後の生成物のアノマー構造を逆転する酵素であるが、26番目のThr残基を部位特異的にHis残基に置換したT26H変異型酵素は、加水分解生成物のアノマー構造を保持する酵素に変換されるのみならず、高い糖転移活性を獲得する。一般に糖加水分解酵素では、酸性残基の2つのカルボン酸がそれぞれ酸塩基触媒として機能するが、T26H変異型酵素ではカルボン酸の代わりにヒスチジン側鎖が反応に関与する。そこで、変異型酵素に導入したHis残基の糖転移反応における役割と隣接する酸性残基(Asp20)との関係を中性子構造解析により明らかにするため、T26H変異型T4Lの完全重水素化とその大型結晶作製を試みた。タンパク質試料は、一般的な大腸菌発現ベクター(pET-24a)を用い、完全重水素化培地で組換え大腸菌を培養後、過剰発現させることによって調製した。取得した試料を用いて、タンパク質濃度と沈殿剤濃度を変化させたスクリーニングを実施し、約0.9mmの結晶を取得した。米国オークリッジ国立研究所の研究用原子炉(HFIR)に設置されたイメージングプレート単結晶回折計(IMAGINE)を用いた室温での中性子回折実験の結果、2.1分解能の回折強度データを完全性79.8%で収集することに成功した。
廣本 武史; 清水 瑠美; 安達 基泰; 柴崎 千枝; 黒木 良太
no journal, ,
T4ファージリゾチーム(T4L)は、大腸菌の細胞壁を構成するムラミルペプチドを加水分解し、溶菌を引き起こす酵素である。26番目のThr残基をHis残基に置換したT26H変異型酵素は、加水分解生成物のアノマー構造を保持する酵素に変換されるのみならず、高い糖転移活性を獲得する。一般に糖加水分解酵素では、酸性残基の2つのカルボン酸がそれぞれ酸塩基触媒として機能するが、T26H変異型酵素ではカルボン酸の代わりに同じ位置を占めるヒスチジン側鎖が反応に関与すると考えられている。そこで変異型酵素に導入したHis残基の糖転移反応における役割と隣接する酸性残基(Asp20)との関係を中性子構造解析により明らかにするため、T26H変異型T4Lの完全重水素化とその大型結晶作製を試みた。タンパク質試料は、一般的な大腸菌発現ベクター(pET-24a)を用い、完全重水素化培地で組換え大腸菌を培養後、過剰発現させることによって調製した。精製試料を用い、約0.9mmの結晶を作製した。米国オークリッジ国立研究所の研究用原子炉(HFIR)に設置されたイメージングプレート単結晶回折計(IMAGINE)を用い、室温での中性子回折実験を実施した結果、2.1分解能の回折強度データを完全性79.8%で収集することに成功した。現在、同一結晶より収集した1.7分解能のX線データを併用し、分子モデルの同時精密化を進めている。
柴崎 千枝; 安達 基泰; 廣本 武史; 清水 瑠美; 黒木 良太
no journal, ,
カゼインキナーゼ(CK2)は、その過剰な発現と、発癌や癌転移との関係が指摘されていることから、創薬標的タンパク質の一つとなっている。我々は、CK2の中性子結晶構造解析によって、阻害剤開発に有効な水素・水和構造に関する立体構造的知見を得ることを目的として、大型結晶作製と予備的中性子回折実験を実施した。大腸菌にて過剰発現させたCK2a(触媒サブユニットのみ)をカラムクロマトグラフィーによって精製し、大型結晶の作製を試みた。CK2の阻害剤であるEmodinとCX-4945との複合体試料について、約40mg/mLに濃縮したタンパク質試料に種結晶を加えることによって、約2mmの大型結晶を得ることができた。取得した結晶を、重水および重水素化試薬を用いて作製した溶液に対して透析処理した後、ミュンヘン工科大学の研究用原子炉(FRM-II)に設置の中性子回折計(BioDIFF)を用いて、予備的中性子回折実験を実施した。結晶を100Kに冷却し、約30分間照射した結果、阻害剤非結合型、Emodin複合体、CX-4945複合体についてそれぞれ、1.9, 2.0, 1.8の分解能を示す回折点の観測に成功した。
