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論文

Crystal growth procedure of HIV-1 protease-inhibitor KNI-272 complex for neutron structural analysis at 1.9 ${AA}$ resolution

清水 典子*; 杉山 成*; 丸山 美帆子*; 高橋 義典*; 安達 基泰; 玉田 太郎; 日高 興士*; 林 良雄*; 木村 徹*; 木曽 良明*; et al.

Crystal Growth & Design, 10(7), p.2990 - 2994, 2010/06

 被引用回数:11 パーセンタイル:73.7(Chemistry, Multidisciplinary)

本研究では、HIV-1プロテアーゼとその阻害剤であるKNI-272との複合体の大型結晶作製を6種類の方法で行った。それらを比較した結果、top-seeded solution growth(TSSG)法とTSSG combined with the floating and stirring technique(TSSG-FAST)法が、種結晶の多結晶化を効果的に防ぎ、迅速に大型の単結晶を得るために有効で、得られた結晶は質が高いことが示された。さらに、結晶の形が、溶液の流れに依存したことから、過飽和の程度が結晶の成長方向に影響することが示唆された。これらの知見は、溶液の流れを操作することで、結晶の形が制御できる可能性を示している。

論文

Small-sized human immunodeficiency virus type-1 protease inhibitors containing allophenylnorstatine to explore the S2' pocket

日高 興士*; 木村 徹*; Abdel-Rahman, H. M.*; Nguyen, J.-T.*; McDaniel, K. F.*; Kohlbrenner, W. E.*; Molla, A.*; 安達 基泰; 玉田 太郎; 黒木 良太; et al.

Journal of Medicinal Chemistry, 52(23), p.7604 - 7617, 2009/07

 被引用回数:18 パーセンタイル:47.34(Chemistry, Medicinal)

HIVプロテアーゼのS2'ポケットと相互作用する部位に着目し、アロフェニルノルスタチンを基本構造としてHIVプロテアーゼに対するさまざまな阻害剤を合成した。その中で、比較的小さいアリル基の導入が有効であり、既に臨床薬の候補となっている阻害剤KNI-764(JE-2147, AG-1776, SM-319777)と比較しても同等の活性があることがわかった。KNI-727にanilinic基を導入することで、水溶性と抗HIV活性を改善した。P2'の位置に$$beta$$-methallyl基を持つKNI-1689複合体のX線結晶構造解析の結果、KNI-764の場合と同じく疎水性のアミノ酸のAla28, Ile84, Ile50'と疎水性相互作用していることが明らかとなった。KNI-1689のアリル基中のメチル基の存在によって、KNI-764以上の抗HIV活性が示された。このことは、構造の最小化と膜透過性のための理論的な薬剤設計に関して重要な知見である。

論文

Structure of HIV-1 protease in complex with potent inhibitor KNI-272 determined by high-resolution X-ray and neutron crystallography

安達 基泰; 大原 高志; 栗原 和男; 玉田 太郎; 本庄 栄二郎; 岡崎 伸生; 新井 栄揮; 正山 祥生; 木村 要*; 松村 浩由*; et al.

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 106(12), p.4641 - 4646, 2009/03

 被引用回数:100 パーセンタイル:91.04(Multidisciplinary Sciences)

本研究では、プロテアーゼとその医薬品候補分子との分子間相互作用を原子レベルで解明することを目的として、阻害剤との複合体の中性子結晶構造解析を実施した。タンパク質の中性子結晶構造解析を行うには、高品質な大型結晶作成のために大量のタンパク質試料が必要となる。本研究では、コドン配列を最適化した人工遺伝子を合成することで効率的な大腸菌発現系を構築し、プロテアーゼの大量調製系を確立した。そして逆相クロマトグラフィーを用いることで自己分解物を完全に除去した純度の高い試料を調製して結晶化を行った。得られた結晶を用いてJRR-3に設置しているBIX-4にて中性子回折データを収集した結果、1.9${AA}$の回折データを得ることができた。プログラムPHENIXにより中性子とX線の同時精密化を実施し、世界で初めてHIV-1プロテアーゼの中性子結晶構造解析に成功した。重水素原子の存在と位置を確認するためにオミットマップを作成したところ、顕著な2つのピークを得た。プロトン化された触媒残基及び阻害剤のヒドロキシル基の構造を水素原子を含めて実験で初めて明らかにすることができた。

論文

Crystallization and preliminary neutron diffraction studies of HIV-1 protease cocrystallized with inhibitor KNI-272

松村 浩由*; 安達 基泰; 杉山 成*; 岡田 詩乃*; 山上 恵*; 玉田 太郎; 日高 興士*; 林 良雄*; 木村 徹*; 木曽 良明*; et al.

Acta Crystallographica Section F, 64(11), p.1003 - 1006, 2008/11

 被引用回数:16 パーセンタイル:78.13(Biochemical Research Methods)

本論文では、HIV-1プロテアーゼと薬剤候補分子であるKNI-272との複合体の結晶化と予備的中性子結晶構造解析について報告する。この中性子回折研究の目的は、水素原子の構造情報を得ることと活性中心の2つのアミノ酸残基の解離状態を決定することである。結晶化は、2液法を除冷法を組合せて、さらにマクロシーディングを繰り返し、1.4mm$$^{3}$$のサイズの結晶を得た。中性子回折データは、原子力機構のJRR-3に設置してあるBIX-4を用いて室温にて行った。回折データの分解能2.3${AA}$、空間群はP2(1)2(1)2、格子定数は、a=59.5, b=87.4, c=46.8${AA}$であった。

口頭

Crystal structure of HIV protease complexed with KNI-272 at 1.1 angstroms resolution

安達 基泰; 玉田 太郎; 日高 興士*; 林 良雄*; Freire, E.*; 木曽 良明*; 黒木 良太

no journal, , 

HIVプロテアーゼ(HIVPR)は、ウイルスのポリプロテインを切断するアスパラギン酸プロテアーゼであり、ウイルスに必須の酵素である。HIVPRインヒビターは、SSDB(Structure based Drug Design)によって開発され、エイズの治療に使われている多剤併用療法に貢献したことが知られている。しかしながら、HIVPR阻害薬による副作用と薬剤耐性ウイルスの出現が抗ウイルス治療において解決されるべき重要な課題となっている。本研究では、HIVPRとインヒビターの相互作用及びHIVPRの薬剤耐性についてさらに理解を深めるために、中性子構造解析と高分解能X線結晶構造解析を用いて研究を進めている。HIVPRは、人工遺伝子を化学的に合成後、大腸菌発現系によって得られたものを再生している。結晶化は、カルボキシメチルイソステアを含む阻害剤KNI-272との複合体で行い、これまでの報告よりも硫安濃度が低い2%の条件で行った。結晶の分解能は、1.1オングストロームであり、これまで報告されているものより大きく改善された。現在、異方性の温度因子を使い精密化を進めており、より詳細な結合している水分子を含めた詳細な構造と動的な温度因子の情報が得られる予定である。

口頭

Neutron crystal structure analysis of HIV-1 protease complexed with KNI-272

安達 基泰; 大原 高志; 栗原 和男; 玉田 太郎; 本庄 栄二郎; 岡崎 伸生; 新井 栄揮; 正山 祥生; 松村 浩由*; 杉山 成*; et al.

no journal, , 

HIV-1プロテアーゼの阻害薬は、HIV-1プロテアーゼの構造をもとに作製され、抗エイズ薬の一つとして多剤併用療法の原動力となっている。しかし、薬剤耐性ウイルスの出現のために、より効果的な薬の開発が望まれている。本研究では、HIV-1プロテアーゼと阻害剤の相互作用及び触媒機構の理解をさらに深めるために、阻害剤KNI-272とHIV-1プロテアーゼとの中性子構造解析を実施した。その結果、KNI-272のApnsのカルボニルグループが、プロトン化されたAsp25と水素結合を形成すること、Apnsのヒドロキシルキがプロトン化されていないAsp25と水素結合を形成することが示された。それらの結果は、触媒反応においてAsp25が基質にプロトンを供与し、Asp125は加水分解に使われる水分子を活性化していることを示している。

口頭

Neutron crystallography for investigation of catalytic mechanism of HIV-1 protease

安達 基泰; 大原 高志; 栗原 和男; 玉田 太郎; 本庄 栄二郎; 岡崎 伸生; 新井 栄揮; 正山 祥生; 木村 要*; 松村 浩由*; et al.

no journal, , 

本研究では、プロテアーゼとその医薬品候補分子との分子間相互作用を原子レベルで解明することを目的として、阻害剤との複合体の中性子結晶構造解析を実施した。タンパク質の中性子結晶構造解析を行うには、高品質な大型結晶作成のために大量のタンパク質試料が必要となる。本研究では、コドン配列を最適化した人工遺伝子を合成することで効率的な大腸菌発現系を構築し、プロテアーゼの大量調製系を確立した。そして逆相クロマトグラフィーを用いることで自己分解物を完全に除去した純度の高い試料を調製して結晶化を行った。得られた結晶を用いてJRR-3設置しているBIX-4にて中性子回折データを収集した結果、1.9Aの回折データを得ることができた。プログラムPHENIXにより中性子とX線の同時精密化を実施し、世界で初めてHIV-1プロテアーゼの中性子結晶構造解析に成功した。重水素原子の存在と位置を確認するためにオミットマップを作成したところ、顕著な2つのピークを得た。プロトン化された触媒残基(Asp25)及び阻害剤のヒドロキシル基の構造を水素原子を含めて実験で初めて明らかにすることができた。

口頭

HIV-1プロテアーゼの中性子結晶構造解析

安達 基泰; 大原 高志; 栗原 和男; 玉田 太郎; 本庄 栄二郎; 岡崎 伸生; 新井 栄揮; 正山 祥生; 松村 浩由*; 杉山 成*; et al.

no journal, , 

本研究では、HIV-1プロテアーゼとその阻害剤分子との分子間相互作用を原子レベルで解明することを目的として、阻害剤KNI-272との複合体の中性子結晶構造解析を実施した。HIV-1プロテアーゼ遺伝子のコドン配列を大腸菌発現に最適化した人工遺伝子を合成し、大量発現系を確立した。精製には、陽イオン交換及び逆相クロマトグラフィーを用い、自己分解物を除去した純度の高い試料を調製した。結晶化は、2液バッチ法により行い、体積3.6mm$$^{3}$$の大型結晶を作製することに成功した。得られた結晶からJAEAのJRR-3に設置している回折計BIX-4にて1.9${AA}$分解能の中性子回折データを収集した。さらに1.4${AA}$分解能のX線回折データも収集し、プログラムPHENIXにより中性子とX線の両方の回折データを用いて立体構造を精密化した。中性子のデータに対しR値19.3% (freeR値22.2%)、X線のデータに対しR値17.3%(freeR値20.3%)まで構造を精密化した。その結果、2つの触媒残基(Asp25及びAsp125)のプロトン化状態と水素原子を含めた立体構造を実験的に明らかにすることができた。

口頭

薬剤耐性A17型HIV-1プロテアーゼと阻害剤複合体のX線結晶構造解析

安達 基泰; 新井 栄揮; 玉田 太郎; 黒木 良太; 日高 興士*; 木村 徹*; 木曽 良明*

no journal, , 

本研究では、ロピナビルに対して耐性を獲得したA17株ウイルス由来(A17型)HIV-1プロテアーゼの薬剤耐性獲得機構を原子レベルで解明し、より効果的な阻害剤の設計において有用な知見を得ることを目的として、ロピナビル及び耐性変異体に効果の高い阻害剤KNI-1657との複合体のX線結晶構造解析を実施した。A17型HIV-1プロテアーゼ遺伝子のコドン配列を大腸菌発現に最適化した人工遺伝子を合成し、野生型と同様な方法で調製した。得られた精製試料を用いて、A17型HIV-1プロテアーゼの活性発現に対するロピナビルの阻害効果を調べたところ、野生型に比較して700倍以上減少していた。一方で、KNI-1657はロピナビルよりも約20倍高い阻害効果を示した。A17型HIV-1プロテアーゼとロピナビル及びKNI-1657との複合体を結晶化した結果、PEG4000を沈殿剤とした条件で結晶化に成功した。得られた結晶を用いて、放射光施設(PF及びSPring-8)にて1.5${AA}$分解能の回折データを収集し、R値19%まで構造を精密化した。

口頭

Structure of HIV-1 protease in complex with potent inhibitor KNI-272 determined by neutron crystallography

安達 基泰; 大原 高志; 栗原 和男; 玉田 太郎; 本庄 栄二郎*; 岡崎 伸生; 新井 栄揮; 正山 祥生*; 松村 浩由*; 安達 宏昭*; et al.

no journal, , 

HIV-1プロテアーゼの触媒機構を解明するために、HIV-1プロテアーゼとペプチドに類似した阻害剤KNI-272との複合体の中性子結晶構造解析を行った。その結果、阻害剤KNI-272の一部であるアロフェニルノルスタチンのカルボキシル基がプロトン化したAsp25残基と水素結合を形成し、一方で、アロフェニルノルスタチンの水酸基が脱プロトン化したAsp125残基と水素結合を形成していることが明らかとなった。以上の結果は、Asp25残基がHIV-1プロテアーゼの基質のカルボキシル基にプロトンを供与し、Asp125が求核攻撃を行う水分子を活性化する役割を持つことを示している。

口頭

放射光と中性子を相補的に用いたヒト免疫不全ウイルスプロテアーゼ-阻害剤の立体構造解析

安達 基泰; 大原 高志; 栗原 和男; 玉田 太郎; 本庄 栄二郎*; 岡崎 伸生; 新井 栄揮; 正山 祥生*; 松村 浩由*; 杉山 成*; et al.

no journal, , 

本研究では、HIV-1プロテアーゼとその医薬品候補分子との分子間相互作用を原子レベルで解明することを目的として、阻害剤KNI-272との複合体の結晶構造解析をX線及び中性子の両方の量子ビームを用いて実施した。最終的に中性子のデータに対しR値19.3%(freeR値22.2%)、X線のデータに対しR値17.3%(freeR値20.3%)まで構造を精密化し、HIV-1プロテアーゼの中性子結晶構造解析に成功した。さらに、SPring-8のBL41XUにおいて、クライオ条件(100K)で分解能0.93${AA}$の回折データを取得し、プログラムSHELX-97により構造をR値10.4%(freeR値12.4%)にまで精密化した。そして、触媒残基のカルボキシル基の炭素原子と酸素原子の間の結合長を求めた結果、触媒残基の2つのアスパラギン酸(Asp25とAsp125)のうちAsp25のみがプロトン化されていることが示唆され、中性子構造解析の結果と一致した。これらの知見は、HIV-1プロテアーゼの触媒機構の解明及びより親和性の高い医薬品候補分子の創製において重要である。

口頭

Structure of HIV-1 protease in complex with potent inhibitor KNI-272 determined by neutron crystallography

安達 基泰; 大原 高志; 栗原 和男; 玉田 太郎; 本庄 栄二郎*; 岡崎 伸生; 新井 栄揮; 正山 祥生*; 松村 浩由*; 安達 宏昭*; et al.

no journal, , 

HIV-1プロテアーゼはヒト免疫不全ウイルス(エイズウイルス)が産生する酸性プロテアーゼであり、Asp25とAsp125を触媒残基としている。HIV-1プロテアーゼはエイズウイルスの増殖に必須であることから、エイズ治療のための創薬標的タンパク質となっている。本研究では、HIV-1プロテアーゼとその医薬品候補分子との分子間相互作用を原子レベルで解明することを目的として、阻害剤KNI-272との複合体の結晶構造解析をX線及び中性子の両方の量子ビームを用いて実施した。

口頭

HIT-Vプロテアーゼの一本鎖化と阻害剤複合体のX線結晶構造解析

安達 基泰; 玉田 太郎; 黒木 良太; 日高 興士*; 木村 徹*; 木曽 良明*; 山本 航平*; 城所 俊一*

no journal, , 

HIV-1プロテアーゼ(HIVPR)は、エイズ治療のための創薬標的タンパク質である。HIVPRに対する阻害剤設計においては、立体構造の特徴と阻害剤結合の速度論的・熱力学的解析から得られるパラメーターの相関を明らかにすることが重要である。本研究では、阻害剤結合による熱安定性の変化を指標として阻害剤結合を評価するため、プロトマー間でN及びC末端が隣接することに着目し、タンデムに結合した遺伝子間に2アミノ酸残基分のリンカー配列を挿入することで、一本鎖化HIVPRの作製を試みた。一本鎖化HIVPRは、野生型と同様に大腸菌内に封入体として発現した。リフォールディングした一本鎖化HIVPRを精製し、KNI-272との複合体を結晶化した。得られた結晶を用いて、放射光施設(SPring-8)にて1.3${AA}$分解能の回折データを収集し、R値19%まで構造を精密化した。一本鎖化HIVPRの立体構造は、野生型とほとんど同じ(RMSD[C$$alpha$$]=0.17${AA}$)であったが、挿入したリンカー部分の電子密度は観測されなかった。同試料を用いた阻害剤結合の評価結果も報告する。

口頭

SS結合の導入によるHIV-1プロテアーゼの一本鎖化

安達 基泰; 新井 栄揮; 松本 富美子; 黒木 良太; 畠中 孝彰*; 伊東 祐二*; 日高 興士*; 津田 裕子*; 木曽 良明*

no journal, , 

HIV-1プロテアーゼ(HIVPR)はエイズ治療における創薬標的タンパク質である。HIVPRの阻害剤との相互作用解析を目的に、野生型HIVPR及びA17型薬剤耐性HIVPR(A17-HIVPR)に人工的に架橋構造を取らせた誘導体を創製し、阻害剤親和性の比較を行うことにした。われわれはまずHIVPRがC2対称であることに着目し、2回軸付近でかつ基質結合部位の反対側に位置するAsn98をCys98残基に置換することで、SS結合形成型の一本鎖化N98C/HIVPR及びN98C/A17-HIVPRの作製を試みた。N98C/HIVPR及びN98C/A17-HIVPRを、野生型と同様に大腸菌内に封入体として発現させた。既報の方法に従ってリフォールディングした結果、SS結合形成型の収率は、野生型と同程度であった。N98C/HIVPR及びN98C/A17-HIVPR両試料の阻害剤複合体の結晶構造と物理化学的手法による阻害剤相互作用についても報告する。

口頭

Lead optimization of allophenylnorstatine-containing inhibitors as therapeutic drug and application to peptidomimic protease probe

日高 興士*; 安達 基泰; 黒木 良太; 渡海 智子*; 赤路 健一*; 津田 裕子*; 木曽 良明*

no journal, , 

HIVプロテアーゼの阻害剤の開発において、2,6-ジメチルフェノキシアセチル構造をもった阻害剤の酵素阻害活性が、ウイルスに対する活性と異なることが問題になっている。現在、阻害剤の疎水性を減少させた強力な阻害剤の開発を進めている。今回、アミノ置換が阻害剤の溶解度を上げ、酵素に対するだけでなく、ウイルスに対する活性も維持していること見いだした。この結果は、Apns構造含有の阻害剤の開発と、酸性プロテアーゼ一般の阻害剤の利用を促進するものである。

口頭

Use of substituted oxamide structure in designing pseudo-symmetric HIV protease inhibitors to employ multiple bridging water molecules

日高 興士*; 戸田 侑紀*; 安達 基泰; 黒木 良太; 木曽 良明*

no journal, , 

分子力学的ダイナミクスシミュレーションにより、薬剤耐性変異型HIVプロテアーゼと阻害剤との間の結合に、新たな架橋水の存在が示唆されている。そこで、架橋水の数を増やすことを目的に、HMCを基本とした疑似対称なペプチド様阻害剤の両端にスルフォニルとオキサミドを導入した。結果として、オキサミド導入において、ロピナビル耐性変異体に対する阻害活性の減少が抑えられていた。このことは、架橋水導入が、耐性変異体変異体の阻害剤開発に有効であることを示す。

口頭

X-ray structure analysis of the single-chain derivatives of HIV-1 protease in complex with inhibitor

安達 基泰; 畠中 孝彰*; 伊東 祐二*; 日高 興士*; 津田 裕子*; 木曽 良明*; 黒木 良太

no journal, , 

HIV-1プロテアーゼ(HIVPR)は、ウイルスの増殖に必須な酵素であることから、エイズ治療のための創薬標的タンパク質である。HIVPRに対する阻害剤設計において、立体構造の特徴と阻害剤結合の速度論的・熱力学的解析から得られるパラメーターの相関を明らかにすることが重要である。本研究では、阻害剤結合による熱安定性の変化を指標として阻害剤結合を評価するため、リンカー配列の挿入とSS結合の導入により2種類の1本鎖型HIVPRの作製を試みた。1本鎖化HIVPRは、野生型と同様に大腸菌内に封入体として発現した。リフォールディングした1本鎖化HIVPRを精製後、ヒドロキシメチルカルボニル構造を持つ阻害剤KNI-272との複合体の結晶を作製し、結晶構造解析を行った。その結果、設計した1本鎖化HIVPRは野生型と同等の構造を持つことが示された。本発表では、同試料を用いた阻害剤結合の評価結果も報告する。

口頭

不活性型一本鎖HIV-1プロテアーゼと阻害剤KNI-272との複合体のX線結晶構造解析

安達 基泰; 清水 瑠美; 黒木 良太; 森谷 圭介*; 城所 俊一*; 日高 興士*; 津田 裕子*; 木曽 良明*

no journal, , 

エイズ治療の創薬標的タンパク質であるHIV-1プロテアーゼ(HIVPR)の阻害剤開発において、薬剤耐性に有効な阻害剤設計のためには、阻害剤複合体及び基質複合体の立体構造の特徴と、速度論的・熱力学的解析より得られるパラメーターの相関の解明が必要である。本研究では、一本鎖化したHIVPR(scHIVPR)及びA17型薬剤耐性変異体(scA17-HIVPR)を利用することにより、Asp25のみをAsnに置換したD25N-scHIVPR及びD25N-scA17-HIVPRを作製した。D25N-scHIVPR及びD25N-scA17-HIVPRの阻害剤複合体の結晶を使い、放射光施設(PF)において、それぞれ1.1${AA}$及び1.5${AA}$分解能の回折データを収集した。立体構造を精密化した結果、いずれの酵素においても阻害剤との相互作用を確認できた。導入したAsnの側鎖のアミノ基は、阻害剤のカルボニル基と水素結合していた。

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