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論文

Development of a technique for high pressure neutron diffraction at 40 GPa with a Paris-Edinburgh press

服部 高典; 佐野 亜沙美; 町田 真一*; 阿部 淳*; 舟越 賢一*; 有馬 寛*; 岡崎 伸生*

High Pressure Research, 39(3), p.417 - 425, 2019/06

AA2019-0119.pdf:1.79MB

 被引用回数:9 パーセンタイル:77.94(Physics, Multidisciplinary)

パリエジンバラプレスを用いた40GPaでの高圧中性子回折実験の手法の開発をJ-PARCのPLANETビームラインにおいて行った。実験可能圧力限界を拡大するために、焼結ダイヤモンドアンビルの上部にある試料装填のためのくぼみの直径を4.0mmから1.0mmに順に小さくしていった。その結果、最大発生圧力は上昇し、最終的に40GPaに到達した。この技術を、回折に寄与する試料領域を制限できる光学系と組み合わせることによって、そのような高い圧力で、広いdレンジを用いた構造解析を行うのに十分な回折パターンを取得できるようになった。

論文

超高圧中性子回折装置PLANETで何ができるか?

服部 高典; 佐野 亜沙美; 町田 真一*; 阿部 淳*; 舟越 賢一*; 岡崎 伸生*

日本結晶学会誌, 59(6), p.301 - 308, 2017/12

PLANETは、高圧実験専用の中性子ビームラインである。J-PARCの強力な中性子源と飛行時間型粉末中性子回折用に設計された高圧デバイスを組み合わせることにより、0-20GPaおよび77-2000Kの広い温度圧力範囲にわたって、結晶、液体および非晶質固体の精密な構造解析が可能になる。このビームラインは、地球物理学, 惑星科学, 物理学, 化学における様々な研究に有効である。本稿では、ビームラインを概説し、PLANETで得られた最新の結果を紹介する。

論文

Materials and Life Science Experimental Facility at the Japan Proton Accelerator Research Complex, 3; Neutron devices and computational and sample environments

坂佐井 馨; 佐藤 節夫*; 瀬谷 智洋*; 中村 龍也; 藤 健太郎; 山岸 秀志*; 曽山 和彦; 山崎 大; 丸山 龍治; 奥 隆之; et al.

Quantum Beam Science (Internet), 1(2), p.10_1 - 10_35, 2017/09

J-PARC物質・生命科学実験施設では、中性子検出器、スーパーミラーや$$^{3}$$Heスピンフィルターなどの光学機器、及びチョッパー等の中性子デバイスが開発され、据え付けられている。また、計算環境として機器制御、データ取得、データ解析、及びデータベースの4つのコンポーネントが整備されている。また、物質・生命科学実験施設では実験に使用される様々な試料環境が利用可能である。本論文では、これらの現状について報告する。

論文

高圧中性子ビームラインPLANETの概要と中性子回折実験の実際

服部 高典; 佐野 亜沙美; 有馬 寛*; 舟越 賢一*; 阿部 淳*; 町田 真一*; 岡崎 伸生*; 大内 啓一*; 稲村 泰弘

高圧力の科学と技術, 26(2), p.89 - 98, 2016/06

PLANETはJ-PARCの物質・生命科学実験施設(MLF)のパルス中性子源に建設された高圧ビームラインである。飛行時間型(TOF)中性子回折実験のために設計された6軸型マルチアンビルプレスを用いて、定常的には、約10GPa, 2000Kまでの高温高圧下でのデータ測定が可能である。ビームラインには、高圧セル等からの寄生散乱が混入しないように、シャープな入射スリットとラジアルコリメータが装備されており、きれいな回折パターンが取得できるようになっている。この特徴に加え、高い分解能($$Delta d/d$$$$sim$$0.6%)で広いd範囲(0.2-8.4${AA}$)のデータを取得できるため、高温高圧下における結晶及び液体の構造を高い精度で決定することが可能となっている。

論文

Structure of a highly acidic $$beta$$-lactamase from the moderate halophile ${it Chromohalobacter}$ sp.560 and the discovery of a Cs$$^{+}$$-selective binding site

新井 栄揮; 米澤 悌*; 岡崎 伸生*; 松本 富美子*; 柴崎 千枝; 清水 瑠美; 山田 貢*; 安達 基泰; 玉田 太郎; 河本 正秀*; et al.

Acta Crystallographica Section D, 71(3), p.541 - 554, 2015/03

 被引用回数:4 パーセンタイル:40.84(Biochemical Research Methods)

蛋白質を利用した希少・有害金属捕集材料の研究開発の一環として、中度好塩菌Chromohalobacter sp.560由来・高酸性$$beta$$-Lactamase(HaBLA)のX線結晶構造を解明するとともに、X線異常分散測定により、HaBLA分子上のCs$$^{+}$$, Sr$$^{2+}$$結合部位の抽出を試みた。PFのNW3AにてHaBLAのX線結晶構造を解明した後、Cs吸収端($$lambda$$=2.175${AA}$)近傍のX線を利用できるSAGA-LSのBL7やPFのBL17A、及び、Sr吸収端($$lambda$$=0.770${AA}$)近傍のX線を利用できるSPring-8のBL38B1やPFのBL5Aなどを使用して、HaBLA分子に結合したCs$$^{+}$$及びSr$$^{2+}$$を同定した。その結果、HaBLA分子上に少なくとも1ヶ所のCs$$^{+}$$結合部位、3ヶ所のSr$$^{2+}$$結合部位を発見した。特に、今回発見したCs$$^{+}$$結合部位は、Na$$^{+}$$がCs$$^{+}$$の9倍量存在する条件下(Na$$^{+}$$/Cs$$^{+}$$ = 90mM/10mM)でもCs$$^{+}$$を選択的に結合できることが明らかになった。このCs$$^{+}$$選択的結合部位は、Trp側鎖のベンゼン環によるカチオン-$$pi$$相互作用、および、主鎖の2つの酸素原子によってCs$$^{+}$$を結合していた。本研究で得たCs$$^{+}$$結合部位の立体構造情報は、原発事故によって放出された放射性Cs$$^{+}$$を捕集する蛋白質材料の設計(人工的Cs$$^{+}$$結合部位の設計)の土台として利用できる。

論文

核鑑識技術の確立に向けた核物質の特性解析に係る取組み

岡崎 日路; 角 美香; 佐藤 光弘; 茅野 雅志; 影山 十三男; Martinez, P.*; Xu, N.*; Thomas, M.*; Porterfield, D.*; Colletti, L.*; et al.

核物質管理学会(INMM)日本支部第35回年次大会論文集(インターネット), 9 Pages, 2015/01

日本原子力研究開発機構プルトニウム燃料技術開発センター(以下、プルセンター)技術部品質管理課では、MOX燃料製造における計量管理及び工程管理を目的として、核燃料物質中のプルトニウム・ウランの同位体組成及び含有率分析、並びに不純物分析・物性測定等を行っている。これらの分析技術は、核燃料物質の組成及び物理・化学形態等を分析し、その出所、履歴、輸出経路等を特定する核鑑識に対しても有効であることから、プルセンターでは、核鑑識に関して豊富な経験を持ち、確立された分析手法を有しているロスアラモス国立研究所と共同研究を実施し、分析方法及び手順、データ等の比較を行い、核燃料物質の特性解析について研究開発を進めている。本論文では、核燃料物質の特性解析技術開発に向けてプルセンターが取組んだ内容について紹介する。

論文

Crystal structures of the catalytic domain of a novel glycohydrolase family 23 chitinase from ${it Ralstonia}$ sp. A-471 reveals a unique arrangement of the catalytic residues for inverting chitin hydrolysis

有森 貴夫*; 川本 乃理子*; 新家 粧子*; 岡崎 伸生*; 中澤 昌美*; 宮武 和孝*; 深溝 慶*; 上田 光宏*; 玉田 太郎

Journal of Biological Chemistry, 288(26), p.18696 - 18706, 2013/07

 被引用回数:22 パーセンタイル:58.33(Biochemistry & Molecular Biology)

${it Ralstonia}$ sp. A-471由来のキチナーゼC(Ra-ChiC)の活性ドメインはG型リゾチームと類似した配列を有し、他のキチナーゼとは異なりGHファミリー23に属する。しかしながら、NMRを用いた解析ではRa-ChiCはキチン二量体と相互作用する一方で、ペプチドグリカン断片とは相互作用しなかった。本論文では、Ra-ChiCの活性ドメイン(野生型, E141Q, E162Q変異体)及びキチンオリゴ糖複合体の結晶構造解析を報告する。Ra-ChiCは基質特異性をつかさどるトンネル構造を含む基質結合部位を有しており、そのトンネル上に位置するAsp226が塩基触媒として水分子を活性化する機構が構造情報に基づく変異体解析の結果から示唆された。構造的に高く保存された酸触媒として機能するGlu141とこのAsp226の相対配置は、他のGH23型酵素や反転型GH19キチナーゼとは異なっており、Ra-ChiCの特徴的な機能と関連していると考えられた。

論文

Substrate recognition mechanism of a glycosyltrehalose trehalohydrolase from ${it sulfolobus solfataricus}$ KM1

岡崎 伸生; 玉田 太郎; Feese, M. D.*; 加藤 優*; 三浦 裕*; 米田 俊浩*; 小林 和男*; 近藤 恵二*; Blaber, M.*; 黒木 良太

Protein Science, 21(4), p.539 - 552, 2012/04

 被引用回数:3 パーセンタイル:7.91(Biochemistry & Molecular Biology)

Glycosyltrehalose trehalohydrolase (GTHase) is an $$alpha$$-amylase that cleaves the $$alpha$$-1,4 bond adjacent to the $$alpha$$-1,1 bond of maltooligosyltrehalose to release trehalose. In order to investigate the catalytic and substrate recognition mechanisms of GTHase, two residues, Asp252 (nucleophile) and Glu283 (general acid/base), located at the catalytic site of GTHase were mutated (Asp252 $$rightarrow$$ Ser (D252S), Glu (D252E) and Glu283 $$rightarrow$$ Gln (E283Q)), and the activity and structure of the enzyme were investigated. The E283Q, D252E and D252S mutants showed only 0.04%, 0.03%, and 0.6% of enzymatic activity against the wild-type, respectively. The crystal structure of the E283Q mutant GTHase in complex with the substrate, maltotriosyltrehalose (G3-Tre), was determined to 2.6 ${AA}$ resolution. The structure with G3-Tre indicated that GTHase has at least five substrate binding subsites and that Glu283 is the catalytic acid, and Asp252 is the nucleophile that attacks the C1 carbon in the glycosidic linkage of G3-Tre. The complex structure also revealed a scheme for substrate recognition by GTHase. Substrate recognition involves two unique interactions: stacking of Tyr325 with the terminal glucose ring of the trehalose moiety and perpendicularly placement of Trp215 to the pyranose rings at the subsites -1 and +1 glucose.

論文

A Structural mechanism for dimeric to tetrameric oligomer conversion in ${it Halomonas}$ sp. nucleoside diphosphate kinase

新井 栄揮; 米澤 悌; 岡崎 伸生; 松本 富美子; 玉田 太郎; 徳永 廣子*; 石橋 松二郎*; Blaber, M.; 徳永 正雄*; 黒木 良太

Protein Science, 21(4), p.498 - 510, 2012/04

 被引用回数:15 パーセンタイル:39.86(Biochemistry & Molecular Biology)

さまざまな生物種で保存されているヌクレオシドニリン酸キナーゼ(NDK)は、4量体もしくは6量体構造を形成することが知られる。一方、中度好塩菌${it Halomonas}$ sp. 593由来NDK(HaNDK)はNDKとしては例外的に2量体を形成し、E134A変異導入により4量体へ変換される。本研究では、ゲルろ過光散乱及びX線結晶解析により、中度好塩菌${it Halomonas}$ sp. 593由来NDKにおけるE134A変異導入による多量体変換の機構を解明した。また、E134A変異型HaNDKの結晶中には、グラム陰性菌由来MxNDKに類似した4量体構造と大腸菌由来EcNDKに類似した4量体構造が交互に現れることを明らかにした。一般に蛋白質は会合することで熱安定性や基質親和性を増大することから、少ない変異導入による多量体構造の変化は、NDKがさまざまな環境に適合するために有効に寄与している可能性がある。

論文

Crystallization and preliminary neutron diffraction studies of ADP-ribose pyrophosphatase-I from ${it Thermus thermophilus}$ HB8

岡崎 伸生; 安達 基泰; 玉田 太郎; 栗原 和男; 大賀 拓史*; 神谷 信夫*; 倉光 成紀*; 黒木 良太

Acta Crystallographica Section F, 68(1), p.49 - 52, 2012/01

 被引用回数:1 パーセンタイル:20.29(Biochemical Research Methods)

ADP-ribose pyrophosphatase-I from ${it Thermus thermophilus}$ HB8 (${it Tt}$ADPRase-I) prevents the intracellular accumulation of ADP-ribose by hydrolyzing it to AMP and ribose 5'-phosphate. To understand the catalytic mechanism of ${it Tt}$ADPRase-I, it is necessary to investigate the role of glutamates and metal ions as well as the coordination of water molecules located at the active site. A macroseeding method was developed in order to obtain a large ${it Tt}$ADPRase-I crystal which was suitable for a neutron diffraction study to provide structural information. Neutron and X-ray diffraction experiments were performed at room temperature using the same crystal. The crystal diffracted to 2.1 and 1.5 ${AA}$ resolution in the neutron and X-ray diffraction experiments, respectively. The crystal belonged to the primitive space group ${it P}$3$$_{2}$$21, with unit-cell parameters $$a$$ = $$b$$ = 50.7, $$c$$ = 119 ${AA}$.

論文

Crystallization and preliminary X-ray diffraction studies of the catalytic domain of a novel chitinase, a member of GH family 23, from the moderately thermophilic bacterium ${it Ralstonia}$ sp. A-471

岡崎 伸生; 有森 貴夫; 中澤 昌美*; 宮武 和孝*; 上田 光宏*; 玉田 太郎

Acta Crystallographica Section F, 67(4), p.494 - 497, 2011/04

 被引用回数:3 パーセンタイル:43.75(Biochemical Research Methods)

Chitinase from the moderately thermophilic bacterium ${it Ralstonia}$ sp. A-471 (Ra-ChiC) is divided into two domains: a chitin-binding domain (residues 36-80) and a catalytic domain (residues 103-252). Although the catalytic domain of Ra-ChiC has homology to goose-type lysozyme, Ra-ChiC does not show lysozyme activity but does show chitinase activity. The catalytic domain with part of an interdomain loop (Ra-ChiC$$_{89-252}$$) was crystallized under several different conditions using polyethylene glycol as a precipitant. The crystals diffracted to 1.85 ${AA}$ resolution and belonged to space group ${it P}$6$$_{1}$$22 or ${it P}$6$$_{5}$$22, with unit-cell parameters ${it a}$ = ${it b}$ = 100, ${it c}$ = 243 ${AA}$. The calculated Matthews coefficient was approximately 3.2, 2.4 or 1.9 ${AA}$ $$^{3}$$ Da$$^{-1}$$ assuming the presence of three, four or five Ra-ChiC$$_{89-252}$$ molecules in the asymmetric unit, respectively.

論文

Towards investigation of the inhibitor-recognition mechanisms of drug-target proteins by neutron crystallography

黒木 良太; 岡崎 伸生; 安達 基泰; 大原 高志; 栗原 和男; 玉田 太郎

Acta Crystallographica Section D, 66(11), p.1126 - 1130, 2010/11

 被引用回数:2 パーセンタイル:32.06(Biochemical Research Methods)

酵素は重要な創薬標的蛋白質の一つである。酵素の反応メカニズムや基質・阻害剤との相互作用様式についての知見は、医薬品候補分子の設計において有用な情報を与える。中性子を用いる蛋白質の立体構造解析は、酵素の機能や分子認識において重要な役割を有する水素原子に関して、重要な情報を提供することができる。原子力機構の研究炉(JRR3)に設置された生体高分子用中性子回折計(BIX-3/4)を用いて実施した、2つの創薬標的蛋白質(ヒト免疫不全ウイルス及び膵臓エラスターゼと遷移状態アナログとの複合体)の中性子立体構造解析の結果について紹介する。

論文

中性子回折による蛋白質単結晶の構造解析

栗原 和男; 岡崎 伸生; 黒木 良太

Radioisotopes, 59(4), p.263 - 277, 2010/04

中性子を結晶構造解析に応用すれば、物質中の水素などの軽原子の識別、存在の有無や位置の決定が容易にできる。生命現象の中で蛋白質や水和水中の水素原子の果たす役割は大変重要である。この分野での中性子結晶構造解析では、弱い線源強度を補い効率の良い測定を可能にするための回折装置や試料調製・結晶化技術の開発が成されてきた。日本では、中性子イメージングプレートを検出器として用いた単結晶中性子回折装置BIX-3, BIX-4が建設され、X線データからは予測困難な水素原子位置の決定,水素結合配置の詳細,水和水の持つ配向自由度の様式などの研究に貢献してきた。一方、X線回折との相補的な利用も進み、最近ではX線との同時構造精密化法を用いた創薬標的蛋白質に対する中性子構造解析から、その酵素反応機構の解明や水素がかかわる特殊な立体構造の観察に成功してきている。得られた水素・水和構造の情報は、世界初の生体水素水和水データベースに集約され、水素情報の統計的な様相が解析可能になっている。海外を含め、新たな回折装置,試料調製・結晶化技術や解析手法の開発への取り組みは現在もなお進められており、水素含めた機能解明や研究機会のさらなる拡大を目指している。

論文

Structure of HIV-1 protease in complex with potent inhibitor KNI-272 determined by high-resolution X-ray and neutron crystallography

安達 基泰; 大原 高志; 栗原 和男; 玉田 太郎; 本庄 栄二郎; 岡崎 伸生; 新井 栄揮; 正山 祥生; 木村 要*; 松村 浩由*; et al.

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 106(12), p.4641 - 4646, 2009/03

 被引用回数:100 パーセンタイル:91.04(Multidisciplinary Sciences)

本研究では、プロテアーゼとその医薬品候補分子との分子間相互作用を原子レベルで解明することを目的として、阻害剤との複合体の中性子結晶構造解析を実施した。タンパク質の中性子結晶構造解析を行うには、高品質な大型結晶作成のために大量のタンパク質試料が必要となる。本研究では、コドン配列を最適化した人工遺伝子を合成することで効率的な大腸菌発現系を構築し、プロテアーゼの大量調製系を確立した。そして逆相クロマトグラフィーを用いることで自己分解物を完全に除去した純度の高い試料を調製して結晶化を行った。得られた結晶を用いてJRR-3に設置しているBIX-4にて中性子回折データを収集した結果、1.9${AA}$の回折データを得ることができた。プログラムPHENIXにより中性子とX線の同時精密化を実施し、世界で初めてHIV-1プロテアーゼの中性子結晶構造解析に成功した。重水素原子の存在と位置を確認するためにオミットマップを作成したところ、顕著な2つのピークを得た。プロトン化された触媒残基及び阻害剤のヒドロキシル基の構造を水素原子を含めて実験で初めて明らかにすることができた。

口頭

Development of Hydrogen and Hydration Database for Biomolecules (HHDB)

岡崎 伸生; 大原 高志; 海野 久雄*; 茶竹 俊行*; 栗原 和男; Cachau, R. E.*; Blaber, M.*; 新村 信雄*; 黒木 良太

no journal, , 

In protein molecules, key energetic contributors are solvation, desolvation and hydrogen bonding. They contribute protein folding, dynamics and molecular recognition. As a result, more elaborate studies of hydrogen atoms will be great help to recognize protein structures and obtain new findings of them. However, we do not have system which dedicated to characterization and analysis of hydrogen bonding. Therefore, we have developed a database for hydrogen and hydration water molecules. That database named Hydrogen and Hydration Database for Biomolecules (HHDB; http://hhdb.tokai-sc.jaea.go.jp/). Hydrogen bond data stored to HHDB use hydrogen atom coordinates determined directly by neutron diffraction and certain extremely high resolution X-ray diffraction. HHDB provides graphical user interface, users can use it through web browser. HHDB can visualize hydrogen atom positions in protein and solvent, and hydrogen bonding interactions. We are improving the web user interfaces and the performance for usability.

口頭

Neutron crystal structure analysis of HIV-1 protease complexed with KNI-272

安達 基泰; 大原 高志; 栗原 和男; 玉田 太郎; 本庄 栄二郎; 岡崎 伸生; 新井 栄揮; 正山 祥生; 松村 浩由*; 杉山 成*; et al.

no journal, , 

HIV-1プロテアーゼの阻害薬は、HIV-1プロテアーゼの構造をもとに作製され、抗エイズ薬の一つとして多剤併用療法の原動力となっている。しかし、薬剤耐性ウイルスの出現のために、より効果的な薬の開発が望まれている。本研究では、HIV-1プロテアーゼと阻害剤の相互作用及び触媒機構の理解をさらに深めるために、阻害剤KNI-272とHIV-1プロテアーゼとの中性子構造解析を実施した。その結果、KNI-272のApnsのカルボニルグループが、プロトン化されたAsp25と水素結合を形成すること、Apnsのヒドロキシルキがプロトン化されていないAsp25と水素結合を形成することが示された。それらの結果は、触媒反応においてAsp25が基質にプロトンを供与し、Asp125は加水分解に使われる水分子を活性化していることを示している。

口頭

Neutron crystallography for investigation of catalytic mechanism of HIV-1 protease

安達 基泰; 大原 高志; 栗原 和男; 玉田 太郎; 本庄 栄二郎; 岡崎 伸生; 新井 栄揮; 正山 祥生; 木村 要*; 松村 浩由*; et al.

no journal, , 

本研究では、プロテアーゼとその医薬品候補分子との分子間相互作用を原子レベルで解明することを目的として、阻害剤との複合体の中性子結晶構造解析を実施した。タンパク質の中性子結晶構造解析を行うには、高品質な大型結晶作成のために大量のタンパク質試料が必要となる。本研究では、コドン配列を最適化した人工遺伝子を合成することで効率的な大腸菌発現系を構築し、プロテアーゼの大量調製系を確立した。そして逆相クロマトグラフィーを用いることで自己分解物を完全に除去した純度の高い試料を調製して結晶化を行った。得られた結晶を用いてJRR-3設置しているBIX-4にて中性子回折データを収集した結果、1.9Aの回折データを得ることができた。プログラムPHENIXにより中性子とX線の同時精密化を実施し、世界で初めてHIV-1プロテアーゼの中性子結晶構造解析に成功した。重水素原子の存在と位置を確認するためにオミットマップを作成したところ、顕著な2つのピークを得た。プロトン化された触媒残基(Asp25)及び阻害剤のヒドロキシル基の構造を水素原子を含めて実験で初めて明らかにすることができた。

口頭

Development of hydrogen and hydration database for biomolecules (HHDB)

岡崎 伸生; 大原 高志; 海野 久雄*; 茶竹 俊行*; 栗原 和男; Cachau, R. E.*; Blaber, M.*; 新村 信雄*; 黒木 良太

no journal, , 

タンパク質分子において溶媒和や脱溶媒和、並びに水素結合は安定化に大きく影響し、それらはフォールディングやダイナミクス,分子認識に寄与している。したがって、水素原子の詳細な研究はタンパク質分子構造の認識やそれらから新たな知見を得る手段として重要であるが、水素結合の特性を解析するようなシステムはこれまで存在しなかった。そのようなシステムを構築するために、われわれは水素結合並びに水和水のためのデータベース(生体分子水素水和水データベース: HHDB)を開発した。HHDBは中性子結晶構造解析や超高分解能X線結晶構造解析によって決定された水素原子座標と、それらから導かれる水素結合のデータを保持している。HHDBはWebベースのグラフィカルユーザーインタフェース(GUI)を備え、利用者はWebブラウザを通してHHDBの機能を利用することができる、タンパク分子や溶媒分子などの水素原子座標や水素結合の状況を可視化することができる。Fig. 1は水素結合距離と結合角度をHHDBでプロットした例である。このプロットにおいて水素原子が原点に配置され、各点は水素結合受容体にあたり水素までの結合距離と共有結合との角度を示している。現在われわれは、これらのインタフェースの性能や利便性の向上を目指して改良を続けている。

口頭

HIV-1プロテアーゼの中性子結晶構造解析

安達 基泰; 大原 高志; 栗原 和男; 玉田 太郎; 本庄 栄二郎; 岡崎 伸生; 新井 栄揮; 正山 祥生; 松村 浩由*; 杉山 成*; et al.

no journal, , 

本研究では、HIV-1プロテアーゼとその阻害剤分子との分子間相互作用を原子レベルで解明することを目的として、阻害剤KNI-272との複合体の中性子結晶構造解析を実施した。HIV-1プロテアーゼ遺伝子のコドン配列を大腸菌発現に最適化した人工遺伝子を合成し、大量発現系を確立した。精製には、陽イオン交換及び逆相クロマトグラフィーを用い、自己分解物を除去した純度の高い試料を調製した。結晶化は、2液バッチ法により行い、体積3.6mm$$^{3}$$の大型結晶を作製することに成功した。得られた結晶からJAEAのJRR-3に設置している回折計BIX-4にて1.9${AA}$分解能の中性子回折データを収集した。さらに1.4${AA}$分解能のX線回折データも収集し、プログラムPHENIXにより中性子とX線の両方の回折データを用いて立体構造を精密化した。中性子のデータに対しR値19.3% (freeR値22.2%)、X線のデータに対しR値17.3%(freeR値20.3%)まで構造を精密化した。その結果、2つの触媒残基(Asp25及びAsp125)のプロトン化状態と水素原子を含めた立体構造を実験的に明らかにすることができた。

口頭

トレハロース合成にかかわる始原菌由来グリコシルトランスフェラーゼの立体構造解析

岡崎 伸生; 玉田 太郎; 加藤 優*; 三浦 裕*; 小林 和男*; 黒木 良太

no journal, , 

始原菌Sulfolobus shibatae DSM5389由来のGTSaseの結晶化を行い、SPring-8 BL41XUで測定したデータを用いて立体構造を明らかにした。GTSaseは大まかに5つのドメインに分かれており、$$alpha$$-アミラーゼファミリーに広く見られる($$beta$$/$$alpha$$)8バレル触媒ドメインを含んでいる。そのバレル構造中には、一つのグルタミン酸(Glu269)、及び二つのアスパラギン酸(Asp241及びAsp460)が見られ、これらの立体配置は$$alpha$$-アミラーゼファミリーに属する他の酵素と同様に保存されていることから、活性中心及び糖分解機構も類似していると考えられる。活性中心を含むクレフトの形状及び性質は基質であるマルトオリゴ糖を収納するに適していた。また、活性中心近傍にはMg$$^{2+}$$イオンと思われる電子密度を中心とし、水分子,グリセロール分子を含んだ水素結合ネットワークが形成されている。本発表では今回明らかにできたGTSaseの立体構造を報告するとともに、立体構造情報とわれわれがこれまでに取得している生化学的知見を統合することにより、GTSaseの触媒機構についても原子レベルで言及したい。

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