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reductase by X-ray crystallography; New insights into regulation of efficient electron transfer山田 貢*; 玉田 太郎; 竹田 一旗*; 松本 富美子*; 大野 拓*; 小杉 正幸*; 高場 圭章*; 正山 祥生*; 木村 成伸*; 黒木 良太; et al.
Journal of Molecular Biology, 425(22), p.4295 - 4306, 2013/11
被引用回数：21 パーセンタイル：50.49(Biochemistry & Molecular Biology)NADHシトクロム還元酵素(b5R)はNADHドメインとFADドメインの2つのドメインからなるフラボタンパク質で、NADHから二個の電子を受け取り、二分子のシトクロム(Cb5)に一電子ずつ伝達する反応を触媒する。今回、ブタ肝臓由来b5Rの還元型および酸化型の両状態における結晶構造解析に成功した。嫌気環境下で作製した結晶を用いて1.68
分解能で解析した二電子還元型b5Rの構造は、酸化型と比較して2つのドメインの相対配置がわずかに変化しており、その結果、FADの溶媒露出面積が増大し、FADのイソアロキサジン環のN5原子と、FADからのプロトン放出に関わっていると考えられているThr66の側鎖の水酸基間に水素結合が形成していた。一方、イソアロキサジン環の平面性は、還元型においても酸化型と変わらず保持されており、NAD
のニコチンアミド環とスタッキングしていた。また、0.78分解能で解析した酸化型b5Rの構造から、Thr66を介したFADとHis49間の水素結合ネットワークが水素原子の位置情報と共に明らかになった。これらの構造的特徴は、b5Rの触媒サイクルにおいて、電子の逆流を防ぎ、Cb5のような電子受容体への電子移動を促進するものであった。さらに、クライオトラップ法により還元型結晶の大気暴露時間を制御し作製した結晶を用いた解析により、還元型から酸化型への再酸化反応は二段階を経ることが示唆された。
蔵満 康浩*; 中新 信彦*; 近藤 公伯; 坂和 洋一*; 森 芳孝*; 三浦 永祐*; 辻 和樹*; 木村 和哉*; 福持 修司*; 柏原 守*; et al.
Physical Review E, 83(2), p.026401_1 - 026401_6, 2011/02
被引用回数：16 パーセンタイル：65.59(Physics, Fluids & Plasmas)宇宙に漂う宇宙線に含まれる粒子線のエネルギー分布は冪乗に比例する傾向を持つことが知られており、したがって、そのような宇宙線の起源を知るうえで非熱的な加速機構を考えることは本質的である。このような宇宙線の起源の候補として宇宙における衝撃波に沿った相対論的な航跡場加速が考えられている。ここではそのような航跡場をプラズマ中に入射した強力なレーザー光による航跡場による加速として扱い、実験室における天文物理を展開した。
蔵満 康浩*; 中新 信彦*; 近藤 公伯; 坂和 洋一*; 森 芳孝*; 三浦 永祐*; 辻 和樹*; 木村 和哉*; 福持 修司*; 柏原 守*; et al.
Physics of Plasmas, 18(1), p.010701_1 - 010701_4, 2011/01
被引用回数：19 パーセンタイル：62.29(Physics, Fluids & Plasmas)大振幅の光波を有する強力なレーザーパルスを代用することで実験室中のプラズマに宇宙の衝撃波環境のモデル実験を行った。強力なレーザーパルスを爆縮するポリスチレンのシリンダー中で伝搬させ宇宙衝撃波の上流のプラズマ中を伝搬する大振幅光波を模擬した。非熱平衡な電子が生成され、そのスペクトルは2乗の冪に従った。
中新 信彦*; 近藤 公伯; 蔵満 康浩*; 森 芳孝*; 三浦 永祐*; 辻 和樹*; 木村 和也*; 福持 修司*; 柏原 守*; 谷本 壮*; et al.
Applied Physics Letters, 93(8), p.081501_1 - 081501_3, 2008/08
被引用回数：4 パーセンタイル：18.74(Physics, Applied)中空のプラスチックシリンダーを爆縮して過渡的に長尺プラズマチューブを発生し、そこへPWレーザーを入射して相対論電子を発生した。長尺プラズマチューブの条件を変えることで発生相対論電子のスペクトル変調が可能であることが判明した。
黒羽 光雄; 武田 邦雄; 飯塚 昇司; 佐々木 修一; 岡田 敏夫; 磯崎 三喜雄; 大後 美道; 佐藤 稔
PNC TN941 81-49, 204 Pages, 1981/05
高速原型炉「もんじゅ」蒸気発生器の水漏洩検出計としてPNC型ナトリウム中水素検出計が開発された。この長期耐久性を確認するために、4基の水素計を大洗工学センタ内のナトリウム純度管理試験ループに1基、ナトリウム流動伝熱ループに2基および燃料ピン流動試験ループに1基を据付け、最高1万時間を目標にナトリウム実流試験を実施した。試験期間は1977年11月から1980年2月までであった。水素計は2号機MK-2タイプで、これは真空系が動的室と静的室とに分離されているが、フレッキシブルチユーブで両室を結合することも可能な構造のものである。本試験結果、次の成果を得た。(1)4基中2基が目標の1万時間以上を達成した。4基の積算時間の総計は約35,000時間であった。ナトリウム系およびニッケル膜には何の異常もなく、充分な耐久性を確認できたが、2基の真空系に計3回の空気漏洩を経験した。(2)ニッケル膜の水素透過率、およびイオンポンプ出力電流と水素圧力の関係に経時変化はほとんど生じなかった。(3)イオンポンプ排気速度が積算水素排気量の増加とともに低下した。この低下する傾向は水素計によって大きな差があり、2基は初期の200Torr・
を排気する間の変化が著しかった。(4)較正曲線であるナトリウム中水素濃度とポンプ出力電流の関係が経時変化するのは、ポンプ排気速度の変化が主原因であることが判った。(5)ノイズの点で、ポンプ出力電流よりもヌードゲージ出力の方が水素検出計の信号として優れていた。
伊藤 和元*; 和田 寿一*; 武田 邦雄; 高荷 智*; 厚母 栄夫
PNC TN941 76-59, 24 Pages, 1976/06
期間:1971年6月4日
1974年8月26日 目的:永久磁石式小型ナトリウム電磁流量計の出力特性を測定し設定値との比較および出力の経時変化を調べる。要旨:ナトリウム技術開発ループに設置されている永久磁石式小型電磁流量計3式は,既にナトリウム接液時間10,000時間を経過している。この期間中に得られたデータを整理し,流量計出力に対するナトリウム温度の影響,熱起電力による影響および出力の経時変化等を調べ下記結果がえられた。(1)流量と出力電圧は直線関係にある。(2)3式の流量計の単位流量当りの出力電圧は設計値の7792%であった。(3)単位流量当りの出力電圧はナトリウム温度上昇とともに小さくなる傾向があり,その変化は計算値(-0.009%/
)と同程度であった。(4)使用期間中で出力の有意的な経時変化は最大8,2000時間では,認められなかった。
Takeda, Kunio*; Ito, Kazumoto*; Mizutani, Tomonori*; Wada, Juichi*; Takani, Satoru*; Atsumo, Hideo*
PNC TN951 76-04, 64 Pages, 1976/03
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正山 祥生; 玉田 太郎; 黒木 良太; 木村 成伸*; 竹田 一旗*; 林 拓郎*; 三木 邦夫*
no journal, ,
NADH-チトクロームb5還元酵素(b5R)は、FADを持つピリジンヌクレオチド酵素でNADHからcytochrome b5への電子伝達を触媒する酵素である。b5Rは、脂肪酸代謝や、薬物代謝酵素であるチトクロームP450(CYP)の還元に関与している。われわれは、b5Rの構造活性相関を解明するとともに、薬物相互作用にかかわるCYPのb5Rによる還元機構を解明するため、その詳細な立体構造を解析することを目標としている。そのためにまず既報告の手法でブタ肝臓由来のb5Rの膜外領域に存在する触媒ドメインの大腸菌による大量調製を行った。その結果、大腸菌培養液1Lあたり15mgのb5Rを取得した。この試料を用いて既に報告されている結晶化条件[14% PEG4000を含む0.1Mリン酸緩衝液(pH7.7)]で結晶化を行った。結晶を中性子構造解析に用いるためには、大型の結晶を作製する必要がある。そこでマクロシーディング法と蛋白質試料を逐次添加することによって、結晶の大型化に取り組み、これまでに最大長辺が約1mmの大型結晶の調製に成功した。この結晶を用いて現在予備的中性子回折実験を実施中である。
Rの結晶化正山 祥生; 玉田 太郎; 黒木 良太; 木村 成伸*; 竹田 一旗*; 林 拓郎*; 三木 邦夫*
no journal, ,
NADH-シトクロム 還元酵素(b5R)は、FADを持つピリジンヌクレオチド酵素でNADHからcytochrome への電子伝達を触媒する酵素である。このb5Rは脂肪酸代謝や薬物代謝酵素であるシトクロムの還元に関与することが明らかにされている。そこでわれわれはb5Rの構造活性相関を解明するとともに、薬物相互作用にかかわるCYPのb5Rによる還元機構を解明するため、中性子構造解析によって詳細な立体構造の解析を行うことを目標としている。そのためにまず既報告の手法でブタ肝臓由来のb5Rの膜外領域に存在する触媒ドメインの大腸菌による大量調製を行い、発現したb5Rを各種クロマトグラフィーによって高純度に単離精製した。その結果、大腸菌培養液1Lあたり15mgのb5Rを取得した。この試料を用いてb5Rの大型結晶作成に取り組み、マクロシーディングを行った結晶化溶液にタンパク質試料を逐次添加することで体積が約4mm
の大型結晶の調製に成功した。また、この結晶を重水溶液に浸漬し予備的中性子回折実験を行ったところ、最大分解能が2程度の回折点を得ることに成功した。
還元酵素反応中間体のX線結晶構造解析山田 貢; 玉田 太郎; 松本 富美子; 竹田 一旗*; 木村 成伸*; 黒木 良太; 三木 邦夫*
no journal, ,
シトクロム還元酵素(以下R)は2ドメインからなり、ドメイン間に1個のFADを含み、NADHから電子を2つ受け取りシトクロムに伝達する酸化還元酵素である。本研究は還元型Rの結晶解析及び還元型Rから再酸化型Rへの時分割結晶解析によってRの酸化還元サイクルの詳細を解明することを目的とした。還元型Rの構造において、2つのドメインの相対位置が大きく変化していた。FADのイソアロキサジン環部位は折れ曲がらずに平面構造をとっておりNADとスタッキングしていたが、N10窒素は
型の幾何配置をとっていた。また、時分割解析の結果、Rはニコチンアミド部位を押し出す動きと、ADPリボース部位を押し出す動きの2つの動きによってNADを放出していことが明らかになった。上記の結果から、Rは(1)ドメインの相対位置変化によってシトクロム相互作用部位を作り出す機構、(2)FADH
とNADの電荷移動相互作用によって共鳴構造が壊れたFADHが安定化する機構、(3)電荷移動相互作用の消失に伴いニコチンアミド部位を活性中心から放出した後、ADPリボース部位を放出する機構の存在が示唆された。
山田 貢; 玉田 太郎; 松本 富美子; 竹田 一旗*; 木村 成伸*; 黒木 良太; 三木 邦夫*
no journal, ,
シトクロムb5還元酵素(以下、b5R)は、立体構造を構成する2つのドメイン間に1分子のFADを含み、NADHから二個の電子を受け取り、二分子のシトクロムb5に一電子ずつ伝達する酸化還元酵素である。二電子還元型b5R及び再酸化型b5Rの結晶解析によってb5Rの酸化還元サイクルにおける立体構造変化を解明する。二電子還元型b5Rの構造において、2つのドメイン配置が酸化型と比較して大きく変化し、FADのイソアロキサジン環は、平面のままNAD+とスタッキングしていた。さらに、b5Rの触媒サイクルにおいて重要な役割を果たすThr66は酸化型構造では、イソアロキサジン環のN5と水素結合を形成していないが、二電子還元型においては水素結合を形成可能な位置に移動していた。一方、再酸化型b5Rではニコチンアミド部位の電子密度が一部不明瞭な構造(再酸化型1)と、完全に消失した構造(再酸化型2)の2つを決定した。このことは、再酸化反応によってまずニコチンアミドが放出され、次いでADPリボースが放出される機構を示唆する。得られた還元型及び再酸化型b5Rの構造学的情報は、b5Rの機能を理解するうえで有用な知見である。
reductase山田 貢; 玉田 太郎; 松本 富美子; 竹田 一旗*; 木村 成伸*; 黒木 良太; 三木 邦夫*
no journal, ,
シトクロム還元酵素(以下、b5R)は、NADHから二個の電子を受け取り、二分子のシトクロムに一電子ずつ伝達する酸化還元酵素である。本発表では二電子還元型b5R及び再酸化型b5Rの結晶解析の結果を報告する。二電子還元型b5R結晶の作製は、嫌気チャンバー内で実施し、SPring-8 BL38B1にて回折実験を行った。再酸化型b5R結晶は還元型結晶を大気暴露し作製した。二電子還元型b5Rの構造において、2つのドメイン配置が大きく変化し、FADの溶媒露出面積が増大した。また、FADのイソアロキサジン環は、折れ曲がらずに平面構造をとっておりNADとスタッキングしていた。さらに、FADからのプロトン放出にかかわっているとされるThr66は酸化型構造では、イソアロキサジン環のN5と水素結合を形成できない距離に位置していたが、二電子還元型においてはドメイン配置の変化によって水素結合を形成可能な位置に移動していた。一方、再酸化型b5Rでは大気暴露時間が少ないニコチンアミド部位の電子密度が一部不明瞭な構造(再酸化型1)と、ニコチンアミドが完全に消失した構造(再酸化型2)の2つを決定したこのことは、再酸化反応によってまずニコチンアミドが放出され、次いでADPリボースが放出される機構を示唆する。
reductase by X-ray crystallography玉田 太郎; 山田 貢*; 竹田 一旗*; 松本 富美子*; 木村 成伸*; 黒木 良太; 三木 邦夫*
no journal, ,
NADHシトクロム還元酵素(b5R)はNADHドメインとFADドメインの2つのドメインからなるフラボタンパク質で、NADHから二個の電子を受け取り、二分子のシトクロム(Cb5)に一電子ずつ伝達する反応を触媒する。嫌気環境下で作製した結晶を用いて1.68分解能で解析した二電子還元型b5Rの構造は、酸化型と比較して2つのドメインの相対配置がわずかに変化しており、その結果、FADの溶媒露出面積が増大し、FADのイソアロキサジン環のN5原子と、FADからのプロトン放出に関わっていると考えられているThr66の側鎖の水酸基間に水素結合が形成していた。一方、イソアロキサジン環の平面性は、還元型においても酸化型と変わらず保持されており、NADのニコチンアミド環とスタッキングしていた。これらの構造的特徴は、b5Rの触媒サイクルにおいて、電子の逆流を防ぎ、Cb5のような電子受容体への電子移動を促進するものであった。さらに、クライオトラップ法により還元型結晶の大気暴露時間を制御し作製した結晶を用いた解析により、還元型から酸化型への再酸化反応は二段階を経ることが示唆された。
平野 優; 竹田 一旗*; 栗原 和男; 玉田 太郎; 三木 邦夫*
no journal, ,
高電位鉄硫黄タンパク質(HiPIP)は、紅色光合成細菌においてシトクロム
複合体から反応中心複合体への電子伝達を担う水溶性電子運搬タンパク質である。本研究では、HiPIPの高分解能中性子構造解析を目指して、大型結晶の作製、回折データ収集の条件検討を行った。結晶の大型化はマクロシーディング法により行い、体積2mmを超える結晶の作製に成功した。得られた大型結晶を用い、大強度陽子加速器施設J-PARCにおいて予備的回折実験を行ったところ、タンパク質としては世界最高分解能である1.1分解能の回折点を観測することができた。
平野 優; 竹田 一旗*; 栗原 和男; 玉田 太郎; 三木 邦夫*
no journal, ,
電子伝達機構を理解する上では、外殻電子や水素原子の情報を結晶構造精密化において考慮することが重要である。最近我々はSPring-8のBL41XUビームラインにおいて高電位鉄硫黄タンパク質(HiPIP)の0.48分解能の回折データを取得した。HiPIPの構造精密化においては、外殻電子分布を考慮するため
プログラムを用いた多極子解析を行った。多極子解析後、deformation mapにおいてカルボニル酸素の非共有電子対分布や、芳香族環の結合電子分布、Fe
Sクラスター中の鉄原子の
電子分布などの外殻電子分布を確認することができた。また、大強度陽子加速器施設J-PARCのiBIXビームラインにおいて予備的中性子回折実験を行ったところ、HiPIPの体積2.3mmの結晶を用いて1.17分解能の回折点を観測することができた。
還元酵素の中性子構造解析平野 優; 山田 貢*; 栗原 和男; 正山 祥生*; 黒木 良太; 日下 勝弘*; 木村 成伸*; 竹田 一旗*; 三木 邦夫*; 玉田 太郎
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NADH-シトクロム還元酵素(b5R)はフラボタンパク質の1つで、その酸化還元反応に伴いチトクロム等の電子受容体に電子を伝達するが、この反応は小胞体における薬物代謝や脂質合成に深く関与することが知られている。これまでに実施した酸化型および還元型b5RのX線結晶解析の結果から、b5Rの酸化還元サイクルの理解が深まったが、電子授受にかかわる補因子(FAD)や周辺のアミノ酸側鎖の水素原子を含む詳細な構造を決定するには至っていない。そこで、水素原子を含めた詳細な構造情報に基づくb5Rの酸化還元サイクル解明を目指して、b5Rの中性子構造解析を実施した。約2mmの大型結晶を段階的に抗凍結溶液に浸漬することにより低温下での中性子回折実験を実現し、J-PARC/MLFのBL03(iBIX)において1.4分解能の回折データの収集に成功した。引き続き、中性子とX線の両回折データを相補的に用いた構造精密化を行うため、同一結晶を用いてPF BL5AにおいてX線回折実験を行い、0.85分解能の回折データを取得した。本発表では、得られた構造の詳細について紹介する。
平野 優; 玉田 太郎; 栗原 和男; 日下 勝弘*; 大野 拓*; 竹田 一旗*; 三木 邦夫*
no journal, ,
タンパク質の構造形成や酵素反応には水素結合が関与している。これまでタンパク質中の水素原子の構造は、低分子から得られた結合距離、結合角の理想値に基づいて議論されてきた。しかしながら理想値の制約を受けない水素原子の構造情報を取得することは、タンパク質の構造や機能を理解するために重要であると考えられる。高電位鉄硫黄タンパク質(HiPIP)は、紅色光合成細菌の光合成電子伝達系においてはたらく電子運搬タンパク質である。本研究では、HiPIPを用い高分解能での中性子構造解析を行った。中性子回折実験は、大強度陽子加速器施設J-PARC物質・生命科学実験施設(MLF)のBL03(iBIX)ビームラインにおいて行い、タンパク質としては世界最高分解能である1.1オングストローム分解能の回折データを取得することができた。構造精密化の結果、水素原子位置や結合距離など、水素結合を形成する原子の配置、パラメーターについて、従来の理想モデルから外れる例を多数観測することができた。
